Isolamento e Cultura de Células-Tronco Neurais Adultas da Zona Subcalosa de Camundongos

Comece com um cérebro de camundongo em uma matriz cerebral gelada.

Obtenha seções contendo a zona subcalosa ou SCZ. Transfira a seção para um tampão de fosfato frio.

Sob um microscópio de dissecação, corte a parte SCZ.

Pique a SCZ dissecada em pedaços menores.

Transfira esses pedaços para um tampão de digestão. Incubar para dissociar as células do tecido.

Centrifugue e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em um meio adequado.

Transfira as células para uma placa de cultura e adicione fatores de crescimento específicos.

As células-tronco neurais adultas se dividem, formando aglomerados chamados neuroesferas.

A distribuição inadequada de nutrientes em aglomerados de células limita o crescimento celular.

Para dispersar os cachos, centrifugue e descarte o sobrenadante. Ressuspenda os cachos em um tampão de dissociação e incuba.

Pipete a solução para cima e para baixo para gerar células individuais.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as células e transfira-as para um meio adequado para obter uma monocamada.

Depois de dissecado, transfira o cérebro do camundongo para o tampão PBS frio e enxágue-o duas vezes para remover o excesso de sangue. Em seguida, coloque o cérebro na matriz cerebral no gelo e faça cortes coronais para obter fatias de um milímetro de espessura. Posteriormente, transfira as fatias posteriores do cérebro contendo regiões SCZ para PBS frio.

Sob um microscópio de dissecação com baixa ampliação, microdissecar a SCZ da área da substância branca do córtex e do hipocampo com uma agulha dobrada de calibre 30. Em seguida, remova as regiões do córtex acima da SCZ e coloque a SCZ dissecada em PBS frio em uma placa de Petri de 35 milímetros no gelo.

A região da zona subcalosa pode ser dissecada com precisão de todo o tecido usando matriz cerebral e agulha dobrada de calibre 30.

Em seguida, remova o PBS e, em seguida, pique imediatamente os tecidos dissecados em pequenos pedaços. Ressuspenda-os com um mililitro de tampão de digestão. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de 15 mililitros contendo dois mililitros de tampão de digestão. Em seguida, incube-o por 30 minutos em banho-maria a 37 graus Celsius.

Nesta etapa, bata levemente no tubo para dissociar o tecido digerido e, em seguida, centrifugue o tubo a 145 vezes g por cinco minutos. Após cinco minutos, descartar o sobrenadante, ressuspender o tecido digerido com um mililitro de pré-aquecido e dois meios para lavar o tampão de digestão e pipetar suavemente a solução da amostra no máximo cinco vezes.

Em seguida, centrifugue novamente a amostra a 145 vezes g durante cinco minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em um mililitro de meio N2. Coloque um mililitro de meio N2 em uma placa de seis poços não revestida e adicione um mililitro das células suspensas para fazer um volume final de dois mililitros.

Em seguida, adicione 20 nanogramas por mililitro de EGF e 20 nanogramas por mililitro de bFGF em cada poço. Agite suavemente a placa de cultura de seis poços com a mão para misturar os fatores de crescimento adicionados com as células plaqueadas. Em seguida, mantenha a placa de seis poços em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Adicione 20 nanogramas por mililitro de EGF e 20 nanogramas por mililitro de bFGF a cada poço todos os dias durante oito dias. A cada três dias, adicione 200 microlitros de meio N2 para manter aproximadamente dois mililitros do meio. Aqui está uma imagem das neuroesferas após oito dias.

Neste procedimento, reúna as neuroesferas e transfira-as para um novo tubo cônico de 15 milímetros. Centrifugar o tubo a 145 vezes g durante cinco minutos. Posteriormente, descarte o sobrenadante e ressuspenda as neuroesferas com 0,5 mililitros de tampão de dissociação. Incube-os com 0,5 mililitros de tampão de dissociação por cinco minutos em banho-maria a 37 graus Celsius para dissociar as neuroesferas em células únicas.

Pipetar suavemente a solução da amostra para cima e para baixo menos de cinco vezes e centrifugar o tubo a 145 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender as neuroesferas com um mililitro de meio N2. Depois de revestir uma placa de seis poços com laminina PLL, coloque as células em 2,5 x 10⁵ células por mililitro com dois mililitros de meio N2 por poço. Mantenha as células-tronco neurais adultas SCZ com um tratamento diário de fatores de crescimento por cinco dias antes de passá-las.