Estabelecendo uma co-cultura de células da polpa dentária e neurônios do trigêmeo para comunicação cruzada

Comece com uma suspensão mesenquimal rica em células-tronco obtida do tecido da polpa dentária de camundongos.

Incubar para permitir a adesão e proliferação celular, formando uma monocamada.

Coloque uma inserção de membrana porosa revestida com laminina no poço que contém as células da polpa dentária.

Semeie a inserção com um meio de co-cultura contendo neurônios trigêmeos derivados do cérebro do camundongo. Incubar para permitir a fixação dos neurônios.

Substitua o meio por um meio de co-cultura contendo reguladores de crescimento, como uridina e 5-fluoro-2 desoxiuridina.

Essas moléculas entram nas células e controlam o crescimento de células-tronco mesenquimais em proliferação ativa, inibindo a síntese de DNA.

Com o tempo, as células mesenquimais secretam pequenas moléculas de sinalização que passam pela membrana porosa para estimular os neurônios do trigêmeo.

Essa estimulação faz com que os processos neuronais dos neurônios do trigêmeo se alonguem em direção às células mesenquimais. Além disso, os neurônios secretam moléculas de sinalização, permitindo a comunicação cruzada.

Após a eutanásia do mouse, coloque a cabeça em uma almofada descartável de modo que a boca fique voltada para o teto e a base do pescoço plana na superfície de trabalho. Use uma lâmina de barbear em um movimento de serra para separar a mandíbula da maxila. Remova a língua com uma tesoura ou fórceps para facilitar o acesso aos molares.

Coloque a cabeça aberta em um prato em cima de uma gaze estéril e coloque a amostra sob um microscópio de dissecação. Remova o tecido ósseo alveolar ao redor dos primeiros molares. Insira uma pinça na abertura alveolar e afaste o tecido do dente em direção ao lado bucal ou lingual da boca.

Colete todos os primeiros molares superiores e transfira suavemente os primeiros molares submandibulares e superiores para uma placa de cultura de células separada com 1X PBS no gelo. Remova os órgãos externos do esmalte ao redor da parte externa de cada primeiro molar superior. Com um conjunto de pinças, gire os molares para que as cúspides fiquem para baixo e a raiz aberta fique exposta. Há uma abertura oval na parte inferior do dente e tecido pulpar dentário opaco encapsulado por uma fina camada de dentina e esmalte.

Usando a ponta da pinça, afrouxe suavemente a polpa dentária passando um braço da pinça ao redor da circunferência interna do tecido mineralizado. Remova o tecido da polpa dentária da estrutura mineralizada e transfira-o para um terceiro prato contendo 1X PBS. Remova o órgão externo do esmalte se ainda não estiver separado.

Transfira todo o tecido da polpa dentária para 0,25% de tripsina EDTA em um tubo cônico de 50 mililitros. Vortex a mistura e coloque-a em banho-maria morno a 37 graus Celsius por 10 minutos. Sob uma capa estéril, adicione meios de co-cultura aquecidos a uma proporção final de pelo menos 1 para 1 meio para tripsina para inativar a enzima. Pipete o meio para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de 10 mililitros para dispersar ainda mais a polpa dentária no meio. Evite bolhas grandes.

Transfira 1 mililitro da polpa dentária dispersa para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e permita que as células se fixem e migrem para fora do tecido não desembolsado por 48 horas antes de trocar de meio.

Após a eutanásia e remoção da pele, insira a ponta de uma tesoura de microdissecação na base do crânio. Corte ao longo da sutura sagital do crânio. Faça quatro pequenos cortes horizontais - dois ao longo das suturas coronais pelas orelhas e dois ao longo das suturas lambdoides na base do crânio. Isso cria dois retalhos de osso.

Use a pinça para descascar as duas abas de osso para revelar o cérebro. Localize os gânglios do trigêmeo alojados na dura-máter entre o cérebro e o osso do processo maxilar. Corte os três ramos que viajam para os olhos, maxilas e mandíbula. e use uma pinça fina de ponta reta para transferir os gânglios para PBS 1X frio em um prato com gelo.

Depois que todos os feixes trigêmeos forem colhidos, use uma pinça de frasco para transferir os gânglios para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 5 miligramas por mililitro de colagenase filtrada estéril tipo 2. Vortex, a mistura e coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 25 a 30 minutos. A cada 5 a 10 minutos, retire o tubo do banho-maria, vórtice e retorne ao banho.

Centrifugue a solução de neurônio trigêmeo de colagenase por 2 minutos a 643 vezes g. Sob uma capa de cultura de tecidos, aspire suavemente a colagenase com uma micropipeta e adicione 5 mililitros de tripsina filtrada estéril a 1% tipo 2.

Em seguida, coloque o tubo em um banho-maria a 37 graus Celsius por 25 a 30 minutos e, dentro desse período de tempo, faça um vórtice brevemente a cada cinco minutos. Adicione mídia em uma proporção de 1 para 1 de tripsina para mídia para desativar a tripsina restante.

Conte o número de células e dilua a mistura para 200.000 células por mililitro em meio. Coloque filtros transwell revestidos em poços com polpa dentária. Pipete 250 microlitros no filtro transwell e cultive as células a 37 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, substitua o meio por 1 mililitro de meio de co-cultura suplementado com uma uridina micromolar e 15 micromolares cinco fluoro-2-prime-desoxiuridina para impedir a proliferação excessiva de células mesenquimais que podem impedir o crescimento de neuritos.