Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:46 min. • July 8th, 2025
Semeie células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou iPSCs, em um biorreator. As iPSCs são ressuspensas em meios contendo um inibidor de apoptose celular.
Sob um campo magnético, a roda vertical do biorreator gira a uma velocidade controlada, facilitando o contato célula-célula e a formação de agregados. Remova a maior parte do meio e adicione um novo meio sem o inibidor.
Continue cultivando. Quando os agregados atingirem um tamanho ideal, deixe-os assentar por gravidade. Remova o meio.
Adicione meios de diferenciação contendo fatores de crescimento e cultura com uma velocidade reduzida da roda do biorreator. Os fatores de crescimento promovem a diferenciação neural dentro dos agregados.
Em seguida, adicione meio fresco suplementado com fatores de crescimento e quimiocinas que induzem o desenvolvimento de progenitores cerebelares.
Gradualmente, os progenitores cerebelares se organizam em camadas distintas dentro dos agregados, formando organoides cerebelares iniciais.
Finalmente, adicione um meio neuronal contendo fatores neurotróficos específicos.
Esses fatores induzem a maturação do progenitor cerebelar em neurônios cerebelares funcionais sinapticamente ativos, gerando organoides maduros.
No dia 1, sendo o dia 0 o dia da semeadura do biorreator, coloque o biorreator e a unidade base em uma capela de fluxo estéril. Em seguida, use uma pipeta sorológica para coletar uma amostra de 1 mililitro da suspensão celular. Coloque a suspensão da célula em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Use um microscópio para confirmar se os agregados derivados de iPSC se formaram. Em caso afirmativo, capture imagens dos agregados em 40x ou 100x.
Continuar cultivando as iPSCs no biorreator até que o diâmetro médio dos agregados seja de 100 micrômetros. Em seguida, substitua 80% do meio por mTesR1 novo sem inibidor de ROCK. Quando os agregados atingirem 200 a 250 micrômetros de diâmetro, deixe todos os organoides se depositarem no fundo do biorreator. Em seguida, substitua todo o meio gasto pelo meio de diferenciação gfCDM.
Coloque a unidade base e o biorreator na incubadora e diminua a agitação para 25 RPM.