Isolando células imunes infiltrantes de tumor de um cérebro murino

Pegue um cérebro de camundongo perfundido contendo um tumor.

A etapa de perfusão remove as células imunes circulantes, mas retém as células infiltradas pelo tumor.

Isole o tecido que contém o tumor.

Agora, dissocie mecanicamente o tecido.

A força mecânica solta o tecido, liberando as células.

Transfira o tecido dissociado para um tubo.

Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo detritos.

Ressuspenda o tecido em uma solução de digestão contendo colagenase e DNase.

A colagenase degrada a matriz extracelular, liberando as células. DNase degrada o DNA contaminante.

Adicione um tampão para interromper a atividade enzimática.

Filtrar a suspensão para remover os agregados celulares e obter uma suspensão unicelular.

Centrifugue e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda as células em um meio de gradiente de alta densidade. Agora, sobreponha com um meio de gradiente de densidade mais baixa, formando um gradiente de separação com uma interface clara.

Centrifugue para separar as camadas. As células imunes se reúnem na interface entre os meios de gradiente enquanto os detritos celulares flutuam no topo.

Colete as células imunes para análise posterior.

Neste procedimento, usando uma lâmina de barbear limpa e de um gume, isole a área do cérebro, contendo o tumor, fazendo um corte sagital no centro do cérebro para dividir os dois hemisférios. Vire o hemisfério ipsilateral com o lado medial para baixo e faça um corte coronal no cerebelo e outro corte no bulbo olfatório para isolar o tecido-alvo que contém o implante tumoral.

Em seguida, coloque o tecido alvo no moedor de tecido de vidro rotulado, contendo 1 mililitro de DPBS. Empurre o êmbolo totalmente para baixo e gire sete vezes para romper o tecido. Depois disso, levante o êmbolo para permitir que o líquido volte para o fundo do moedor de tecidos. Repita esta etapa três vezes. No entanto, gire o êmbolo apenas quatro vezes durante as próximas duas repetições e três vezes durante a última repetição para evitar a trituração excessiva do tecido cerebral.

Em seguida, aplique três volumes de 1 mililitro de DPBS gelado nas laterais do êmbolo para enxaguar a matéria cerebral residual no moedor de tecido. Em seguida, ressuspenda a matéria cerebral triturada pipetando para cima e para baixo e coloque em um tubo de centrífuga de 15 mililitros rotulado no gelo. Enxágue as laterais do moedor de lenços DAPS com mais 1 mililitro de DPBS gelado e adicione ao mesmo tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Mantenha todos os tubos contendo matéria cerebral triturada no gelo, até que todas as amostras tenham sido processadas. Em seguida, gire a matéria cerebral triturada nos tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 vezes g por 20 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda a matéria cerebral peletizada em 1 mililitro de uma mistura previamente preparada de enzimas digestivas colagenase e DNase I.

Coloque os tubos de centrífuga de 15 mililitros em um rack de tubos de ensaio e coloque o rack em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos e, em seguida, agite suavemente as amostras duas vezes durante o período de incubação, sacudindo os tubos para facilitar a desagregação do tecido.

Posteriormente, adicione 6 mililitros de DPBS gelada a cada tubo para diluir as enzimas digestivas. Pipete para cima e para baixo para ressuspender e filtre o volume total através de filtros de malha de náilon estéreis de 70 mícrons em novos tubos de centrífuga de 15 mililitros rotulados no gelo.

Depois, gire a suspensão de células cerebrais para baixo a 740 vezes g por 20 minutos a 4 graus Celsius para obter um pellet de célula única. Remova os tubos de 15 mililitros da centrífuga e coloque-os no gelo. Em seguida, aumente a configuração de temperatura na centrífuga para cerca de 21 graus Celsius em preparação para a próxima etapa.

Em seguida, remova totalmente o sobrenadante da célula e ressuspenda inicialmente os grânulos da célula em 1 mililitro de meio de centrifugação de densidade de 70%, usando uma micropipeta P1000. Em seguida, adicione quatro mililitros adicionais de meio de centrifugação de densidade de 70% a cada tubo. Coloque as tampas com segurança e homogeneize a suspensão celular invertendo suavemente o tubo várias vezes.

Depois disso, transfira os tubos de centrífuga de 15 mililitros, contendo células cerebrais ressuspensas em meios de centrifugação de densidade de 70% do gelo para um tubo de ensaio de volta à temperatura ambiente. Um de cada vez, sobreponha cuidadosamente 2 mililitros de solução de meio de centrifugação de densidade de 37% nos 5 mililitros de meio de centrifugação de densidade de 70% para formar uma interface limpa entre as duas camadas de meio de centrifugação de densidade.

Em seguida, marque a posição da interface entre as duas camadas com um marcador de ponta fina para que possa ser facilmente identificada após a centrifugação, quando a distinção se tornar menos aparente. Gire os tubos de centrífuga de 15 mililitros a 740 vezes g por 20 minutos em temperatura ambiente sem interrupção para evitar interromper a interface entre as camadas do meio de centrifugação de densidade.

Em seguida, colete os PBMCs que se acumularam na interface entre as duas camadas de meios de centrifugação de densidade, introduzindo uma micropipeta P200 no tubo, contornando cuidadosamente a camada lipídica. Uma vez no nível da banda PBMC, extraia lentamente 200 microlitros da superfície da camada de meio de centrifugação de 70% de densidade e transfira para um tubo FACS de polipropileno rotulado respectivamente no gelo. Repita esta etapa uma vez para atingir um volume total de 400 microlitros por amostra.