Estabelecendo uma cultura tridimensional de células gliais derivadas do cérebro de rato

Pegue uma microplaca com uma cultura aderente de células gliais derivadas de um cérebro de rato. A cultura contém astrócitos, microglia e oligodendrócitos.

Remova o meio, incube com uma solução enzimática para separar as células e depois transfira-as para um tubo.

Centrifugue e remova o sobrenadante com detritos celulares. Ressuspenda as células em um meio quente.

Triturar usando uma seringa para quebrar os aglomerados de células e filtrar usando um filtro para obter uma suspensão unicelular.

Adicione um biopolímero fotoreticulável, agentes de reticulação e componentes da matriz extracelular.

Despeje a mistura em um molde preso a uma lamínula. Exponha a mistura à luz de alta intensidade para induzir a reticulação, formando um gel e encapsulando as células gliais.

Retire o molde e coloque as lamínulas em uma microplaca. Adicione um meio quente e incube o gel em condições fisiológicas.

As células proliferam dentro da matriz extracelular de suporte e criam uma rede celular, estabelecendo uma cultura tridimensional de células gliais.

24 horas antes do encapsulamento celular, aspire o meio de culturas primárias de duas semanas e adicione 1 mililitro de meio fresco a cada poço. No dia do encapsulamento celular, prepare 12,5 mililitros de tripsina diluída e 25 mililitros de meio para cada placa de 12 poços e aqueça a 37 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para adicionar cerca de 1 mililitro de tripsina diluída a cada poço da placa de 12 poços.

Incube por 20 a 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que a camada de células confluentes se desprenda da placa. Após a incubação, use uma pipeta de 1 mililitro para recuperar as células destacadas, que devem aparecer como uma única peça flutuante, e transfira para um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros. Diluir com um volume equivalente de meio e centrifugar a 200 vezes g durante 2 minutos à temperatura ambiente.

Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 mililitros de meio quente. Triturar as células cinco vezes com a pipeta e, em seguida, centrifugar novamente a 200 vezes g por dois minutos. Após a centrifugação, decantar o sobrenadante, ressuspender as células em 5 mililitros de meio quente e transferir as células para um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros.

Em seguida, usando uma seringa de 10 mililitros com uma agulha de calibre 18, triture a solução celular três vezes e filtre a suspensão através de uma peneira de células de 40 mícrons em um novo tubo de centrífuga cônico. Em seguida, colete 10 microlitros de suspensão celular e dilua de 1 a 100 em meio quente e conte as células com um contador de células automatizado.

Incube as células restantes em banho-maria a 37 graus Celsius até a etapa de encapsulamento. Aqueça 12,5 mililitros de meio ingênuo e 12,5 mililitros de meio condicionado para cada planta Placa de 12 poços de hidrogéis 3D. Em seguida, pesar 7 miligramas de HAMA por planta de placa de 12 poços e adicionar à filtrada estéril para uma concentração de 2% em peso para o volume. Sonicar a solução durante 60 minutos a 20 quilohertz até que o HAMA esteja totalmente dissolvido.

Durante a sonicação, prepare soluções individuais a 10% de TEA e NVP. Prepare também uma solução de eosina a 1 milimolar em alíquotas de 1 mililitro de PBS estéril. Em seguida, para cada placa de 12 poços, faça uma mistura final de 1,4 1,4 mililitro de 1 x 10⁷ células, 0,5% HAMA, 20% de mistura de lâmina basal em PBS, 0,1% TEA, 0,1% NVP e 0,01 milimolar de eosina Y.

Depois de misturar suavemente a solução, use uma pipeta equipada com uma ponta de 1 mililitro para dispensar 100 microlitros em cada molde PDMS. Em seguida, exponha as amostras a uma luz LED verde de alta intensidade em uma caixa fechada por 5 minutos em temperatura ambiente.

A exposição do LED verde de cinco minutos é essencial para formar o gel 3D. A cor vermelha introduzida pela eosina Y se tornará transparente e indicará o término da reação.

Em seguida, adicione 1 mililitro de meio quente e condicionado a cada poço de uma placa de 12 poços; segure cada lamínula entre o polegar e o indicador e use uma pinça curva para retirar lentamente o molde PDMS sem deslocar o gel. Coloque o molde em um poço com meio condicionado.

A remoção do molde é a etapa mais desafiadora. Deve ser feito com o máximo cuidado para evitar o deslocamento do gel e a fratura da lamínula. Isso pode exigir prática.

Depois que todos os moldes forem transferidos para os poços da placa, adicione mais 1 mililitro de meio DMEM/F12 quente a cada poço. Incube as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas semanas antes de obter imagens.