Diferenciando Células-Tronco Pluripotentes Humanas Não Transgênicas e Transgênicas em Células Progenitoras Neurais

Pegue uma placa de vários poços revestida com uma matriz extracelular, ou ECM.

Em poços separados, introduza células-tronco pluripotentes humanas não transgênicas e transgênicas, ou hPSCs, em um meio de cultura.

As hPSCs transgênicas carregam um transgene sob um promotor induzível por antibióticos. O transgene codifica um fator de transcrição que induz a diferenciação neural.

Incubar para facilitar a adesão celular ao ECM. Pequenas moléculas no meio impedem a apoptose, promovendo a proliferação celular.

Adicione uma solução de descolamento para dissociar as células; adicione o meio para interromper a dissociação e, em seguida, transfira-os para outra microplaca revestida com ECM para permitir a proliferação celular.

Introduzir um meio de diferenciação neural contendo pequenas moléculas nas células não transgênicas e o antibiótico indutor nas células transgênicas.

As pequenas moléculas induzem células não transgênicas a se diferenciarem em células progenitoras neurais ou NPCs. Nas células transgênicas, a expressão induzida por antibióticos do fator de transcrição ativa os genes necessários para a diferenciação em NPCs.

Mantenha os NPCs em cultura para aplicativos downstream.

Para a geração de progenitores e neurônios neuronais não transgênicos, ou hNeurons, consulte os progenitores neurais derivados de hPSC no dia 14 em placas de seis poços revestidas com ECM com 2 mililitros de meio neural e Y27632 por poço.

Se estiver trabalhando com iNeurons induzíveis por doxiciclina, adicione meio neural contendo doxiciclina quando as células estiverem cerca de 35% confluentes para induzir a diferenciação e ativar a expressão gênica. Após dois dias, alimente linhagens transgênicas e não transgênicas com 2 mililitros de meios neurais por poço por dia. Continue até que as células estejam prontas para se levantar a 70% de confluência.