Isolamento de neurônios DRG e cocultura com precursores de células de Schwann para gerar células de Schwann

Pegue a medula espinhal de um embrião de rato com gânglios de raiz dorsal anexados, ou DRGs, contendo neurônios e células gliais.

Separe os DRGs individuais do cordão, transfira-os para um tubo e centrifugue, descartando quaisquer detritos de tecido.

Adicione enzimas para dissociar neurônios DRG e células gliais.

Gire as células e remova quaisquer detritos. Adicione um meio de manutenção neuronal e triture para gerar uma suspensão unicelular.

Transferir a suspensão para uma microplaca revestida com um substrato de cultura, promovendo a adesão celular.

Introduza um meio de purificação e incuba. Os agentes inibitórios do meio eliminam as células gliais em divisão, enquanto os neurônios que não se dividem sobrevivem.

Pegue células semelhantes a células de Schwann, ou SCLCs, em um meio de co-cultura. Os CPPCs, precursores das células de Schwann, interagem com neurônios embrionários de nervos periféricos.

Introduza a suspensão nos neurônios DRG e incuba. A interação dos SCLCs com neurônios DRG promove sua maturação em células de Schwann.

As células de Schwann geradas estão prontas para análise.

Para colher os gânglios da raiz dorsal, transfira o primeiro embrião para uma placa de cultura de 10 centímetros contendo PBS em temperatura ambiente sob um microscópio de dissecação em decúbito ventral e insira uma pinça de microdissecação ao longo de ambos os lados da medula espinhal.

Usando dissecção romba, separe a medula espinhal do tecido mole circundante, usando uma pinça para extirpar a medula espinhal ao longo da abertura do pescoço e do toco da cauda. Remova o tecido mole residual da medula espinhal liberada até que apenas a medula espinhal, as raízes nervosas e o gânglio da raiz dorsal anexados permaneçam.

Separe os gânglios da raiz dorsal individuais de suas raízes nervosas de conexão. Em seguida, use uma caneta de pipeta equipada com uma ponta de pipeta de 1 mililitro para transferir até 100 gânglios da raiz dorsal para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro de PBS.

Colete os gânglios por centrifugação e ressuspenda os grânulos em 200 microlitros de reagente de dissociação de células enzimáticas recombinantes por tubo. Após 10 minutos a 37 graus Celsius, centrifugue os gânglios da raiz dorsal novamente usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros para triturar suavemente os grânulos no meio de manutenção do neurônio pós-ganglionar da raiz dorsal.

Semeie as células do gânglio da raiz dorsal a 5 x 10³ células por centímetro quadrado em placas de seis poços revestidas com laminina de poli-D-lisina em 1,5 mililitros de meio de manutenção do neurônio do gânglio da raiz dorsal por poço.

Após dois dias em cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO₂, lave as células e retorne as culturas de células neuronais à incubadora em meio fresco de purificação de neurônios do gânglio da raiz dorsal por mais dois dias.

Após 3 a 4 ciclos de manutenção e purificação, as culturas de células do gânglio da raiz dorsal devem ser positivas para o marcador neuronal Tuj-1 e negativas para o marcador de células gliais S100 beta.

No dia 7 da cultura de células semelhantes a células de Schwann, enxágue as células em PBS, seguido de dissociação com 0,5 mililitros de reagente de dissociação celular enzimática recombinante por poço a 37 graus Celsius por 5 minutos. Ressuspenda o pellet celular em meio de co-cultura e semeie as células semelhantes a células de Schwann na cultura purificada de neurônios do gânglio da raiz dorsal a 1 x 10³ células por centímetro quadrado por 14 dias de co-cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.