Replating de neurônios diferenciados derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Comece com uma grande placa de cultura contendo neurônios diferenciados derivados de células-tronco pluripotentes humanas com uma rede neuronal densa.

Incube esses neurônios com enzimas proteolíticas leves para separá-los da placa, levantando-os como uma folha.

Com a incubação contínua, as enzimas interrompem parcialmente as conexões celulares, afrouxando as redes neuronais.

Adicione um meio de cultura para interromper a atividade enzimática.

Pipete repetidamente os neurônios destacados para separá-los uns dos outros.

Filtre os neurônios através de um filtro de células para remover aglomerados de células e coletar os neurônios individuais.

Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda-os em um meio de crescimento.

Para replatinar, semeie esses neurônios em um polímero e uma placa de vários poços revestida com proteína de adesão. Incube para permitir sua fixação.

Os neurônios utilizam nutrientes do meio para se manterem viáveis. Substitua o meio de cultura regularmente para manter os níveis de nutrientes.

Incubar ainda mais para permitir a maturação neuronal e a formação de conexões entre eles.

Comece enxaguando suavemente a placa de neurônios diferenciados com PBS. Disperse o PBS pela parede da placa, e não diretamente nas células para evitar interrompê-las. Aspire o PBS da borda do prato enquanto o inclina, tomando cuidado para não tocar nas células.

Aplique pelo menos 1 mililitro de enzima proteolítica por placa de 10 centímetros e retorne as células à incubadora por 40 a 45 minutos. Durante a incubação, verifique os neurônios em um microscópio de contraste de fase e continue o tratamento com protease até que a rede neural se desprenda completamente da placa e comece a se separar. Quando os neurônios se separarem, interrompa a digestão adicionando 5 mililitros de meio DMEM fresco para cada 1 mililitro de protease.

Use uma pipeta sorológica para triturar suavemente as células contra a placa 5 a 8 vezes, certificando-se de não aplicar muita pressão. Coe as células através de uma malha de 100 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros gota a gota e enxágue o filtro com mais 5 mililitros de meio DMEM fresco.

Use uma centrífuga de bancada para girar as células a 1.000 vezes g por 5 minutos. Após a centrifugação, retorne o tubo cônico ao gabinete de biossegurança e aspire a maior parte do meio, deixando 250 microlitros para manter as células úmidas. Ressuspenda suavemente as células em 2 mililitros de meio DMEM fresco e passe-as pela extremidade de uma pipeta sorológica de 5 mililitros.

Por fim, inverta o tubo 2 a três vezes. Use um hemocitômetro e azul de tripano para contar as células viáveis e, em seguida, dilua as células com DMEM fresco até a concentração desejada. Adicione suplementos apropriados ao tubo, dependendo dos requisitos da linhagem celular específica, e misture suavemente as células inclinando o tubo cônico 2 a 3 vezes.

Aspire o revestimento de laminina de uma placa de 24 poços e enxágue uma vez com PBS. Aspire o PBS e aplique a solução celular em cada poço em um movimento em forma de oito para evitar aglomeração. Quando terminar de revestir as células, retorne a placa para a incubadora ajustada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.