Desenvolvimento de organoides nervosos motores derivados de iPSC humanos usando um chip microfluídico

Tome células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou iPSCs, em um meio de células-tronco rico em nutrientes com inibidores de Rho-quinase.

Os inibidores entram nas células e bloqueiam as enzimas Rho-quinase, impedindo a morte celular por apoptose.

As células utilizam os nutrientes para proliferar e se agregar espontaneamente para formar um aglomerado de células tridimensional chamado esferóide.

Gradualmente, substitua o meio por um meio de indução neural. Os moduladores de sinalização do meio impulsionam a diferenciação de células-tronco em células neurais.

Substitua por um meio neural rico em fatores de crescimento para diferenciar as células esferóides em neurônios motores e formar um esferóide do neurônio motor ou MNS.

Transfira esses MNS para um chip microfluídico revestido de polímero contendo um meio de maturação.

Os fatores de crescimento nervoso no meio estimulam os axônios ou projeções mais longas de neurônios a crescer a partir do esferóide e se estender através do microcanal do chip.

Isso forma um organoide do nervo motor, um modelo tridimensional do tecido nervoso motor.

Para induzir a diferenciação de células 3D iPS em neurônios motores, semeie 4 x 10⁴ células iPS por poço no número apropriado de poços de uma placa de fundo em U de 96 poços em 100 microlitros de alimentador e meio de cultura de células sem soro suplementado com 10 micromolares Y27632.

No dia seguinte, substitua o sobrenadante em cada poço por 100 microlitros de meio KSR suplementado com 10 micromolares SB-431542 e 100 nanomolares LDN-193189. Nos dias 2 e 3, substitua os sobrenadantes por 100 microlitros de meio KSR suplementado com 10 micromolares SB-431542, 100 nanomolares LDN-193189, 5 micromolares DAPT, 5 micromolares SU-5402, 1 micromolar ácido retinóico e um agonista micromolar suavizado. Nos dias 4 e 5, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 75% de meio KSR e 25% de meio N2, suplementado com 10 micromolares SP-431542, 100 nanomolares LDN-193189, 5 micromolares DAPT, 5 micromolares SU-5402, 1 micromolar ácido retinóico e 1 agonista micromolar suavizado.

Nos dias 6 e 7, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 50% de meio KSR e 50% de meio N2, suplementado com 5 DAPT micromolares, 5 SU-5402 micromolares, 1 ácido retinóico micromolar e 1 agonista alisado micromolar. Nos dias 8 e 9, substitua os sobrenadantes por uma mistura de 25% de meio KSR e 75% de meio N2, suplementado com 5 DAPT micromolares, 5 SU-5402 micromolares, 1 ácido retinóico micromolar e 1 agonista suavizado micromolar. Nos dias 10 e 11, substitua os sobrenadantes por meio N2 suplementado com DAPT 5 micromolar, 5 SU-5402 micromolar, 1 ácido retinóico micromolar e 1 agonista alisado micromolar. No dia 12, substitua os sobrenadantes em cada poço por 100 microlitros de meio de maturação, suplementados com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro por poço.

Para induzir a formação de organoides nervosos motores, substitua a solução de revestimento no chip PDMS por 150 microlitros de meio de maturação suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro e use uma ponta de micropipeta de calibre largo para adicionar suavemente esferóides de neurônios motores de um poço da placa de 96 poços na entrada do microcanal do chip. Coloque um pequeno reservatório de água estéril perto do chip de cultura de tecidos no prato para evitar a evaporação média e coloque o prato em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

A cada dois ou três dias, substitua metade do meio de cultura esgotado do centro do reservatório do meio por meio de maturação fresco suplementado com 20 nanogramas por mililitro de fator neurotrófico derivado do cérebro. Os axônios crescerão do esferóide do neurônio motor para o canal, reunindo-se espontaneamente em um único feixe durante um período de duas a três semanas para formar um organoide do nervo motor.