Geração de progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos pelo método Hanging Drop

0 vistas3:09 min • July 8th, 2025

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Pegue uma suspensão de células-tronco embrionárias de camundongo.

Centrifugue, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um meio de diferenciação neural.

Coloque as gotículas da suspensão no lado interno da tampa de uma placa de cultura.

Adicione um tampão à placa inferior para evitar que as gotículas sequem. Coloque a tampa na placa inferior, formando uma cultura de gota suspensa, e incuba.

Devido à gravidade, as células se agrupam e formam agregados tridimensionais denominados corpos embrióides ou EBs.

Coloque as gotículas em uma placa contendo o meio de diferenciação e incube sob agitação para o crescimento de EBs.

Centrifugar e remover o meio; ressuspender os EB no meio de diferenciação suplementado com ácido retinóico, transferi-los para uma placa de cultura e incubar.

O ácido retinóico entra nas células e desencadeia a formação de um complexo de transcrição. O complexo induz a expressão gênica, desencadeando a diferenciação em células progenitoras neurais.

Os EBs diferenciados estão prontos para aplicações downstream.

Comece configurando a cultura de células suspensas. Para uma placa de cultura de células de 10 centímetros, ajuste a concentração para 500 células por 20 microlitros de meio de diferenciação. Prepare suspensão celular suficiente para 50 gotículas de 20 microlitros. Use uma micropipeta ou uma pipeta repetidora para colocar gotículas de 20 microlitros de suspensão celular na tampa de uma placa de cultura de tecidos, certificando-se de que as gotículas não estejam muito próximas umas das outras para evitar que se fundam.

Encha o prato com 5 a 10 mililitros de PBS e coloque cuidadosamente a tampa de volta no prato. Incube a cultura na incubadora de 37 graus Celsius. Após dois dias, colete as gotículas da tampa e coloque-as em uma placa de suspensão de cultura de células de 10 centímetros, preenchida com 10 mililitros de meio de diferenciação. Em seguida, coloque a placa em um agitador orbital ajustado para baixa velocidade na incubadora. Após mais dois dias, centrifugue as células a 200 vezes g por três minutos e remova o sobrenadante.

Para induzir a diferenciação do corpo embrióide em células progenitoras neurais, ressuspenda as células em meio de diferenciação com ácido retinóico 5-micromolar. Incube a placa por dois dias. Em seguida, substitua a metade mínima do meio por meio novo, inclinando a placa e pipetando-a.

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Última atualização: 15 agosto 2026