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Neurociência
0 vistas • 3:05 min • July 8th, 2025
Comece com uma suspensão celular de células progenitoras hematopoiéticas geneticamente alteradas.
Essas células expressam fatores de transcrição necessários para sua reprogramação em células-tronco neurais. Esse processo é chamado de reprogramação direta.
Transfira as células para uma placa multipoços revestida com matriz extracelular com um meio progenitor neural e incuba.
A matriz extracelular fornece um andaime tridimensional para fixação e crescimento celular.
Durante a incubação, os fatores de transcrição expressos pela célula progenitora hematopoiética iniciam uma sequência de eventos moleculares que permitem sua transformação em uma célula-tronco neural.
O meio progenitor neural contém fatores que favorecem a sobrevivência das células-tronco neurais induzidas.
Após a incubação, substitua este meio por um novo meio progenitor neural para promover a multiplicação celular.
Desconecte as células usando um raspador de células.
Colete esta suspensão e transfira as células para um poço contendo meio de células-tronco neurais.
Incubar para manutenção de células-tronco neurais induzidas.
Quando as células estiverem 30 a 50% confluentes, aspire o sobrenadante e reserve e, em seguida, adicione 1 mililitro de meio progenitor neural a cada poço. Para fazer uma placa de backup usando as esferas do sobrenadante, centrifugue o sobrenadante de reserva a 170 vezes g por 10 minutos.
Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em meio progenitor neural. Placa em placa de 24 poços revestida com matrigel; Troque o meio em cada placa de células a cada dois dias até que as células atinjam 60% a 80% de confluência, geralmente após uma semana.
Assim que as células atingirem a confluência necessária, aspire o sobrenadante e adicione 1 mililitro de meio de células-tronco neurais a cada poço. Em seguida, dissocie as células usando um raspador de células seguido de uma pipetagem muito suave.
Em seguida, transfira as células de um poço da placa de 24 poços para um poço de uma placa de 6 poços. Adicione outro mililitro de meio ao poço e, após repetir o procedimento para todos os poços, coloque a placa de 6 poços na incubadora de dióxido de carbono a 5% de 37 graus Celsius.
Troque o volume total do meio em dias alternados até que as células atinjam 60% de confluência. Após cada vez, dissocie e replaquete as células na proporção de 1 para 3, conforme mostrado.