Silenciamento de genes mediado por siRNA em células-tronco neurais

Pegue o pequeno RNA interferente, ou siRNA, um tipo de RNA envolvido no silenciamento de genes.

Adicione vesículas lipídicas esféricas chamadas lipossomas.

O lipossoma encapsula o siRNA, protegendo-o da degradação.

Adicione complexos siRNA-lipossomas a um poço de cultura contendo células-tronco neurais. Mantenha um bem como controle e incuba.

O lipossomo se funde com a membrana celular, liberando o siRNA.

O siRNA se liga ao complexo de silenciamento induzido por RNA, ou RISC, onde uma fita é removida.

A fita restante tem como alvo o mRNA responsável pela diferenciação celular, levando à sua degradação.

Adicione um meio de diferenciação adequado aos poços.

No poço controle, os fatores de crescimento e outros nutrientes do meio promovem a diferenciação das células-tronco neurais em osteoblastos.

Usando técnicas de coloração adequadas, core marcadores específicos de osteoblastos nas células e comente o núcleo com um corante fluorescente azul.

A ausência de marcadores específicos de osteoblastos nas células silenciadas por genes indica sua incapacidade de diferenciação.

Para realizar o knockdown de siRNA em células O9-1, recupere e semeie as células. Diluir os lipossomas num volume adequado de meios isentos de soro. Em seguida, diluir o siRNA em meio sem soro de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, adicione o siRNA diluído aos lipossomas diluídos de acordo com as instruções do fabricante. Misture a solução pipetando e incube por 5 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um volume apropriado de complexo siRNA-lipídio às células. Em seguida, incube as células por 24 horas em uma incubadora de cultura de células padrão. As células O9-1 podem se diferenciar em diferentes tipos de células sob condições específicas de cultura de diferenciação. Para diferenciar as células O9-1 em osteoblastos, prepare meios de diferenciação osteogênica de acordo com o protocolo de texto. Finalmente, detecte o marcador osteoblasto osteocalcina em osteoblastos diferenciados por imunocoloração.