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Neurociência
0 vistas • 2:35 min • July 8th, 2025
Pegue o pequeno RNA interferente, ou siRNA, um tipo de RNA envolvido no silenciamento de genes.
Adicione vesículas lipídicas esféricas chamadas lipossomas.
O lipossoma encapsula o siRNA, protegendo-o da degradação.
Adicione complexos siRNA-lipossomas a um poço de cultura contendo células-tronco neurais. Mantenha um bem como controle e incuba.
O lipossomo se funde com a membrana celular, liberando o siRNA.
O siRNA se liga ao complexo de silenciamento induzido por RNA, ou RISC, onde uma fita é removida.
A fita restante tem como alvo o mRNA responsável pela diferenciação celular, levando à sua degradação.
Adicione um meio de diferenciação adequado aos poços.
No poço controle, os fatores de crescimento e outros nutrientes do meio promovem a diferenciação das células-tronco neurais em osteoblastos.
Usando técnicas de coloração adequadas, core marcadores específicos de osteoblastos nas células e comente o núcleo com um corante fluorescente azul.
A ausência de marcadores específicos de osteoblastos nas células silenciadas por genes indica sua incapacidade de diferenciação.
Para realizar o knockdown de siRNA em células O9-1, recupere e semeie as células. Diluir os lipossomas num volume adequado de meios isentos de soro. Em seguida, diluir o siRNA em meio sem soro de acordo com o protocolo de texto. Depois disso, adicione o siRNA diluído aos lipossomas diluídos de acordo com as instruções do fabricante. Misture a solução pipetando e incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione um volume apropriado de complexo siRNA-lipídio às células. Em seguida, incube as células por 24 horas em uma incubadora de cultura de células padrão. As células O9-1 podem se diferenciar em diferentes tipos de células sob condições específicas de cultura de diferenciação. Para diferenciar as células O9-1 em osteoblastos, prepare meios de diferenciação osteogênica de acordo com o protocolo de texto. Finalmente, detecte o marcador osteoblasto osteocalcina em osteoblastos diferenciados por imunocoloração.