Isolando colônias de células progenitoras neurais induzidas derivadas de fibroblastos humanos adultos

Comece com uma cultura aderente de colônias de células progenitoras neurais induzidas derivadas de fibroblastos humanos adultos em uma placa de vários poços revestida com laminina.

Lave as colônias com um tampão para remover as células não aderentes e, em seguida, adicione um tampão novo.

Raspe ao redor de colônias individuais para remover as células circundantes.

Transfira as colônias para poços frescos revestidos de laminina contendo meio de neuroindução.

Desagregar mecanicamente as colônias para obter uma suspensão unicelular.

A laminina, uma proteína da matriz extracelular, interage com as proteínas de superfície dos progenitores, facilitando a adesão celular à superfície do poço.

Adicione um inibidor de molécula pequena que entra nas células e bloqueia proteínas quinases específicas, evitando a apoptose celular.

Fatores de crescimento e pequenas moléculas presentes no meio de neuroindução facilitam a proliferação dos progenitores.

Substitua periodicamente o meio para repor os nutrientes, facilitando a proliferação contínua de progenitores.

Uma cultura confluente, ou uma camada de células totalmente coberta, indica a expansão bem-sucedida das células progenitoras neurais induzidas.

Um dia depois, aspire a laminina das placas e adicione 200 microlitros de meio de indução neural aos poços. Lave as placas de seis poços contendo as colônias a serem colhidas, uma vez com DPBS, antes de adicionar 2 mililitros de meio de indução neural por poço de uma placa de seis poços.

Escolha mecanicamente as células raspando as colônias usando uma agulha fina para se livrar das células circundantes e colhendo as colônias usando pontas de pipeta montadas em uma pipeta de 200 microlitros com 50 microlitros.

Transfira cada colônia para um poço de uma placa de 48 poços revestida com laminina e gere uma suspensão unicelular mecanicamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Adicione o inibidor da Rho-quinase em uma concentração final de 10 micromolares às células. Cultive as células na placa de 48 poços a 37 graus Celsius, 5% de CO₂ por dois dias. Troque o meio a cada dois dias até que as células atinjam 80% a 90% de confluência.