JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:22 min • July 8th, 2025
Pegue células-tronco embrionárias de camundongos, ou mESCs, suspensas em um meio de diferenciação e incuba.
Na cultura em suspensão, as mESCs se agregam para formar uma estrutura denominada corpos embrióides ou EBs.
EBs são agregados tridimensionais que imitam um embrião em desenvolvimento e podem ser diferenciados em células neurais.
Transfira os EBs para um tubo e deixe-os assentar por gravidade.
Remova o meio empobrecido em nutrientes; ressuspenda os EBs em um meio fresco e transfira-os para uma placa de cultura.
Incubar a cultura de suspensão para facilitar o crescimento de EBs.
Transfira os EBs suspensos no meio para uma placa multipoços. Os poços são revestidos com uma proteína de adesão, permitindo que os EBs se fixem.
Introduzir ácido retinóico, que entra nas células e desencadeia a formação de um complexo de transcrição.
O complexo induz a expressão gênica, promovendo a diferenciação das células em células progenitoras neurais, ou NPCs, que exibem processos celulares estendidos.
Adicione 1,5 milhão de células-tronco embrionárias de camundongos em uma placa bacteriana não adesiva em 10 mililitros de meio de diferenciação basal e incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a formação do corpo embrióide.
Após dois dias, transfira os agregados de células para tubos de centrífuga de 15 mililitros e deixe-os assentar por gravidade. Remova o sobrenadante e adicione 10 mililitros de meio de diferenciação basal fresco para ressuspender os corpos embrióides. Em seguida, replante-os em um novo prato não adesivo e incube-os por mais dois dias.
Colete e semeie cerca de 50 corpos embrióides em 2 mililitros de meio de diferenciação basal por poço em uma placa de seis poços revestida de gelatina. Para indução de ácido retinóico, adicione 2 microlitros de estoque de RHA em cada poço até uma concentração final de 1 micromolar. Retorne a placa para a incubadora e diferencie as células por mais quatro dias.