JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 5:23 min • July 8th, 2025
Pegue fatias de cérebro obtidas de um cérebro de roedor. As fatias consistem no hipocampo, que contém neurônios do hipocampo.
Transfira as fatias de cérebro para lamínulas contendo plasma de galinha.
Aplique plasma misturado com trombina nas fatias. A trombina induz a coagulação plasmática, criando um andaime biológico que promove a adesão dos cortes às lamínulas.
Pegue tubos de rolos de lados planos com um orifício no lado plano e um disco adesivo preso ao redor do orifício na parte externa dos tubos.
Posicione as lamínulas nos discos adesivos, garantindo que as fatias de cérebro fiquem voltadas para o interior dos tubos.
Adicione um meio de cultura neuronal aos tubos e flua em uma mistura de dióxido de carbono e ar.
Tampe os tubos, insira-os em um rack de rolos e incuba-os com um movimento de rolamento.
A aeração fornecida pela incubação rolante e os nutrientes do meio suportam a cultura a longo prazo das fatias de cérebro.
Para começar, prepare o suporte para tubos de rolos e faça um gabarito para ajudar a fazer um furo nos tubos de rolos, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Usando o gabarito, segure na posição um tubo de cultura de plástico de 1 centímetro de lado plano de modo que o lado plano fique voltado para cima. Em seguida, faça um furo de 6 milímetros de diâmetro com o centro a 1 centímetro do fundo e centralizado entre as laterais do tubo.
Com a ferramenta de rebarbação giratória, alise as bordas do furo e faça quatro ranhuras na borda interna do furo para facilitar a drenagem do furo durante a rotação. Em seguida, enxágue os tubos com etanol a 70% e seque-os ao ar em um armário de segurança biológica. Esterilize os tubos em alguns discos de borracha de silicone adesivos perfurados de 12 milímetros por 40 minutos sob a lâmpada UV.
Após 20 minutos, reposicione os tubos e discos para que todas as superfícies expostas sejam esterilizadas. Em seguida, retire o suporte branco do disco adesivo. Alinhe os orifícios e fixe a borracha de silicone na parte externa do tubo.
Uma vez obtidas as fatias, coloque 2 microlitros de plasma de frango no centro do lado fotogravado de uma lamínula preparada. Espalhe o plasma levemente para obter um ponto de 3 a 4 milímetros de diâmetro. Em seguida, use uma espátula estéril de ponta estreita para levantar uma fatia de cérebro preparada. Use uma pinça fechada para manter a fatia na ponta da espátula enquanto levanta a fatia. Toque a espátula no ponto de plasma na lamínula e, com uma pinça fechada, empurre a fatia para a lamínula.
Adicione uma fina camada de plasma de pintinho na lamínula antes de colocar a fatia e uma quantidade mínima de plasma tratado com trombina para cobrir a fatia. Se a fatia flutuar, ela não permanecerá aderida quando o coágulo for removido.
Em seguida, misture 2,5 microlitros de plasma e 2,5 microlitros de trombina em um tubo separado. Coloque rapidamente 2,5 microlitros dessa mistura sobre e ao redor da fatia e pipete para cima e para baixo suavemente para misturá-la. Remova a cobertura plástica transparente do lado exposto do adesivo de borracha de silicone previamente afixado no tubo do rolo. Em seguida, coloque a lamínula com a fatia de cérebro no adesivo, alinhando a fatia dentro do orifício.
Para garantir a aderência, aplique uma pressão suave e uniforme na lamínula com o polegar, pressionando a lamínula uniformemente e segurando-a por cerca de 1 minuto enquanto a transfere para o gabinete de segurança biológica.
A pressão na lamínula para aderir ao tubo sem vazamento deve ser correta e mantida por tempo suficiente para eliminar os canais de ar no selante. Muita pressão quebrará a lamínula.
Em uma cabine de segurança biológica, adicione 0,8 mililitros de meio de cultura A neurobasal completo a cada tubo. Em seguida, flua uma mistura de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar através de uma pipeta de pastagem estéril com algodão presa por uma braçadeira. Use-o para lavar o tubo do rolo com a mistura de gases e tampe rapidamente o tubo à medida que ele é retirado ao redor da pipeta.
Em seguida, rotule os tubos com o número da fatia e o número do rack. Insira os tubos em um rack de rolos, garantindo que estejam geometricamente equilibrados. Se houver um número ímpar de tubos, adicione tubos vazios para equilibrar.
Coloque os racks em uma incubadora de rolos a 35 graus Celsius com os rolos girando o rack de rolos para manter o meio no fundo dos tubos. Incline a incubadora para trás aproximadamente 5 graus, levantando sua frente sobre uma tábua.