Iniciando a extensão e formação rápidas de neuritos Conexões neuronais funcionais

Comece montando um dispositivo microfluídico contendo microcanais dentro de um prato revestido com lisina.

Semeie neurônios embrionários com um meio de crescimento nos poços microfluídicos, permitindo que eles fluam através dos microcanais.

Incubar para facilitar a fixação e o crescimento neuronal, formando populações neuronais fisicamente isoladas.

Desmonte a configuração e coloque o prato em uma câmara de micromanipulador com fluxo de solução salina para manter a viabilidade celular.

Introduza grânulos revestidos de lisina perto dos neurônios, permitindo que os neuritos ou projeções celulares se liguem e formem complexos de grânulos-neuritos.

Usando um micromanipulador, aplique sucção para envolver um complexo de neurite de um canal.

Puxe este complexo para induzir tensão mecânica, levando a uma rápida extensão do neurite.

Guie-o em direção a outro complexo de neurônios de esferas e segure-o com um segundo micromanipulador.

Mantenha as duas contas no lugar para facilitar a formação de uma conexão neurítica.

Solte a sucção e substitua o soro fisiológico por um meio de cultura.

Incubar para estabelecer conexões funcionais entre os neurônios, promovendo a comunicação por meio de neurotransmissores.

Remova o meio dos poços superiores dos dispositivos microfluídicos sem esvaziar os poços. Em seguida, adicione 20 microlitros da solução celular concentrada no poço superior direito do dispositivo microfluídico e verifique no microscópio como as células fluem dentro do dispositivo microfluídico de população única.

Para plaquear as células no dispositivo de múltiplas populações, adicione 20 microlitros da solução celular concentrada em cada um dos poços superiores. Sob o microscópio, verifique se as células estão dentro das câmaras. Depois, coloque os dispositivos na incubadora por 15 a 30 minutos para promover a fixação das células ao substrato.

Depois que as células se ligarem ao substrato, adicione 40 microlitros de NBM aos dois poços superiores do dispositivo de população única. Isso ajudará a remover as bolhas de ar dos microcanais. Adicione 20 microlitros de NBM aos poços superiores do dispositivo de múltiplas populações, os mesmos poços onde as células foram injetadas. A mídia deve se projetar ligeiramente para formar um menisco positivo e dar aos poços um aspecto de topo de muffin.

Um a dois dias antes da remoção dos dispositivos microfluídicos, adicione 2 mililitros de NBM pré-aquecido a cada prato de amostra e inunde as câmaras. Em seguida, mantenha os dispositivos na incubadora. Em seguida, use uma pinça estéril e uma ponta de pipeta para remover os dispositivos microfluídicos das lamínulas, deixando uma configuração padronizada de neurônios.

Neste procedimento, adicione 40 a 60 microlitros dos grânulos revestidos com PDL preparados à cultura de células. Em seguida, devolva a amostra à incubadora por uma hora para promover a formação de contatos sinápticos. Em seguida, instale a amostra em uma configuração experimental de modo que as células possam ser avaliadas de cima por duas micropipetas e também acessadas opticamente. Nesta configuração, uma câmera CCD está localizada na porta lateral do microscópio para captura de imagem. Conecte cada pipeta cheia de solução salina a uma seringa de 1 mililitro. Em seguida, perfunda a amostra com solução salina fisiológica.

Em seguida, sob o microscópio, verifique a lacuna entre as duas populações neuronais isoladas para garantir que as duas populações não estejam naturalmente conectadas. Selecione um cordão PDL que não esteja conectado ao neurônio no campo de view. Alinhe o cordão com uma ponta de micropipeta concentrando-se no cordão e depois na micropipeta.

Em seguida, abaixe a ponta o mais próximo possível do cordão, monitorando-o ao microscópio. Em seguida, aplique pressão negativa na pipeta para pegar o cordão e mantenha a pressão negativa durante todo o experimento.

Agora, selecione um grânulo PDL conectado a um neurônio no campo de visão e conecte-o à segunda micropipeta usando sucção. Puxe o complexo PDL bead-neuron movendo lentamente o micromanipulador ou o estágio da amostra a 0,5 micrômetros por minuto por 1 micrômetro e faça uma pausa de cinco minutos para permitir a iniciação do neurite.

Puxe o complexo PDL bead-neuron movendo-o lentamente lateralmente a 0,5 micrômetros por minuto em 2 micrômetros. Em seguida, faça uma pausa de cinco minutos para permitir o alongamento do neurite. Após a iniciação bem-sucedida e a extensão do neurite nos primeiros 5 micrômetros, puxe continuamente o neurite a 20 micrômetros por minuto.

Para conectar os neurônios, selecione uma região rica em neurites. Use outros grânulos para medir a altura da ponta da pipeta acima da lamínula e abaixe o complexo PDL bead-neurite para que ele entre em contato fisicamente com os neuritos. Deixe o complexo PDL-neurite em contato com o neurite alvo enquanto manipula a segunda micropipeta. Em seguida, abaixe a segunda pipeta com o segundo cordão PDL em cima do neurite recém-formado a cerca de 20 micrômetros do primeiro grânulo e use o segundo cordão PDL para empurrar o novo filamento de neurite em direção à célula-alvo.

Em seguida, segure as duas contas no lugar por pelo menos uma hora. Verifique a ausência de inchaço focal, um espessamento dos neuritos em contato com o cordão com o microscópio. Durante esse tempo, mude lentamente o meio da amostra de solução salina fisiológica para NBM pré-aquecido com equilíbrio de dióxido de carbono.

Solte o cordão da segunda pipeta liberando a sucção. Se o novo neurite permanecer preso, libere a primeira velocidade também. Depois, coloque cuidadosamente a amostra de volta na incubadora para fortalecer a conexão neuronal para experimentos futuros.