JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:32 min • July 8th, 2025
Introduza fibroblastos dérmicos humanos adultos ou aHDFs, suspensos em um meio de fibroblastos, em uma microplaca revestida com proteína da matriz extracelular. Incubar para permitir a adesão celular.
Introduzir um vetor lentiviral transgênico. Após a internalização na célula hospedeira, o RNA viral é transcrito reversamente em DNA, que se integra ao genoma do hospedeiro.
O DNA viral expressa fatores de transcrição e RNAs de grampo curto, ou shRNAs. As nucleases celulares processam os shRNAs em pequenos RNAs interferentes ou siRNAs.
Os siRNAs gerados degradam o mRNA que codifica os repressores transcricionais, inibindo assim sua expressão e permitindo a ativação de genes de diferenciação neuronal.
Os fatores de transcrição ativam os genes, promovendo a diferenciação neuronal das aHDFs.
Remova o meio que contém os vetores não internalizados.
Adicione um meio de conversão neuronal inicial contendo fatores de crescimento e pequenas moléculas que induzem a diferenciação em células semelhantes a neurônios.
Substitua o meio por um meio de conversão neuronal tardia contendo fatores neurotróficos para maturação em neurônios.
Os neurônios maduros estão prontos para ensaios a jusante.
Prepare uma suspensão celular de 1.320.000 células em 13,2 mililitros de meio fibroblasto para atingir 100.000 células por mililitro de meio. Depois de aspirar a gelatina da placa, lave a placa com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco duas vezes. Em seguida, adicione 500 microlitros de suspensão celular a cada um dos poços e incube a 37 graus Celsius durante a noite.
Aqueça 13,2 mililitros de fibroblastos médios a 37 graus Celsius. Em seguida, descongele o vetor lentiviral na coifa laminar à temperatura ambiente. Adicione o volume necessário de lentivírus necessário para infectar os fibroblastos dérmicos humanos adultos em uma multiplicidade de infecção de 20 ao meio sem nenhum intensificador de transdução.
Em seguida, substitua o meio por 500 microlitros de meio fibroblasto com a adição do vetor lentiviral. Incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua o meio contendo lentivírus por meio de fibroblastos fresco sem o vetor lentiviral. No terceiro dia após a transdução viral, remova o meio de fibroblastos e adicione 500 microlitros de meio de conversão neuronal inicial.
Duas ou três vezes por semana, substitua 225 microlitros de meio antigo de cada poço por 250 microlitros de meio de conversão neuronal novo e precoce. No 18º dia após a transdução viral, remova o meio de conversão neuronal precoce e substitua por 500 microlitros de meio de conversão neuronal tardia. Continue trocando o meio a cada dois ou três dias como antes até o 25º dia ou o ponto final experimental.