Geração e manutenção de culturas de fatias de tecido de glioblastoma humano

Pegue o tecido de glioblastoma humano, um tumor cerebral primário originado de células gliais.

Lave o lenço usando um meio de processamento gelado para remover o sangue residual.

Corte o tecido em pedaços e insira-o em um molde de incorporação contendo agarose derretida.

Resfrie o molde, permitindo que a agarose polimerize e forme uma matriz de gel estável.

Remova o bloco de tecido do molde e fixe-o na placa de amostra de um vibratome.

Adicione o meio de processamento gelado para submergir o bloco. Passe uma mistura de gases oxigenados para arejar o meio, mantendo a viabilidade do tecido.

Corte o tecido tumoral embutido em fatias finas.

Transfira uma fatia para uma placa de Petri contendo o meio de processamento gelado para preservar a arquitetura do tecido.

Em seguida, coloque a fatia de tecido em uma inserção de membrana permeável em um poço contendo um meio de manutenção de cultura de fatias.

Mantenha a fatia em condições fisiológicas. A cultura de fatias está pronta para ensaios a jusante.

Comece usando uma pinça estéril para colocar inserções vazias de cultura de PTFE em cada poço de uma placa de seis poços contendo 1 mililitro de meio de manutenção de cultura de fatias por poço. Quando todas as inserções tiverem sido adicionadas, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos com camisa de água umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO₂.

Em seguida, coloque os pedaços de tecido tumoral em uma placa de Petri contendo meio de processamento gelado e use uma pipeta para lavar suavemente o tecido três vezes com meio fresco para remover quaisquer glóbulos vermelhos aderentes. Após a terceira lavagem, use um bisturi para cortar os pedaços do tumor em tiras de aproximadamente 3 por 3 por 10 milímetros, removendo cuidadosamente todos os vasos presos e evitando tecido necrótico ou cauterizado.

Quando todo o tecido tiver sido aparado, adicione 5 a 7 mililitros de agarose líquida a 37 graus Celsius em um molde de plástico de 2 centímetros cúbicos e leve a agarose à geladeira em uma camada de gelo por um minuto. Coloque 2 a 4 tiras de tecido na agarose, com o eixo longo orientado verticalmente, deixando os tecidos no gelo por mais 2 a 5 minutos após a colocação.

Quando a agarose solidificar, corte as laterais da forma com um bisturi para remover suavemente a agarose do molde e use uma gota generosa de cola de cianoacrilato para fixar o bloco de agarose a uma placa de amostra de vibratomo.

Quando a cola endurecer, mergulhe o bloco de agarose em meio de processamento gelado e use uma pipeta de plástico estéril aparada para borbulhar uma mistura de 5% CO₂ 95% O₂ no meio dentro do reservatório de vibrato. Defina a espessura da fatia do vibratome para 300 a 350 mícrons e ajuste a velocidade avançada da lâmina e a amplitude da lâmina de acordo com a consistência do tecido e as especificações do vibratomo.

Obter o número adequado de fatias de acordo com a análise experimental planeada. Usando uma microespátula de aço inoxidável para transferir as fatias para uma placa de Petri contendo meio de processamento gelado à medida que são adquiridas. Quando todas as fatias tiverem sido adquiridas, use a microespátula para transferir cada fatia para uma única inserção de PTFE.

Após uma incubação de 12 a 24 horas, equilibre uma nova placa de seis poços contendo meio de manutenção de cultura de fatias frescas na incubadora de cultura de células por 15 minutos. Em seguida, use uma pinça estéril para agarrar cada inserto pela borda e transfira os insertos para poços individuais da nova placa de seis poços.