Desenvolvendo um modelo de cultura de células triplas da barreira hematoencefálica humana

Comece adicionando pericitos na parte inferior da inserção do poço.

Cubra o recipiente com uma placa de cultura e incuba.

Os pericitos se ligam à membrana do poço, formando uma camada unicelular ou uma monocamada.

Pegue outro prato de cultura.

Adicione astrócitos humanos ao poço em um meio adequado. Em seguida, incube a placa.

Os astrócitos se fixam no fundo do poço e formam uma monocamada.

Descarte o meio e adicione astrócitos e pericitos frescos.

Agora, pegue a placa de cultura contendo o poço com a camada de pericito.

Inverter a placa e transferir o compartimento para o poço que contém a camada de astrócitos.

Adicione as células endoteliais do cérebro humano ao lado superior do poço e incuba.

As células endoteliais se ligam à inserção do poço, formando um sistema de cultura de células triplas que se assemelha à barreira hematoencefálica, uma interface crucial que separa a corrente sanguínea e o cérebro.

Comece cultivando HBVP em frascos de cultura T75 com uma superfície ativada para adesão celular dentro de uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius até ficar confluente. Uma vez alcançada a confluência, aspire o meio parasita antigo e lave as células com 5 mililitros de PBS de Dulbecco quente. Aspirar o PBS de Dulbecco e separar as células do frasco, utilizando uma combinação de 4 mililitros de solução quente de tripsina-EDTA e 1 mililitro de PBS de Dulbecco.

Incubar o balão durante 5 minutos a 37 graus Celsius numa incubadora de dióxido de carbono. Ver ao microscópio para confirmar se as células estão separadas do frasco. Adicione 5 mililitros de meio parasita quente, contendo 2% de FBS ao frasco, e transfira as células destacadas para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar a suspensão celular durante três minutos a 200 g, permitindo que as células formem um sedimento no fundo do tubo.

Aspire o meio do tubo, garantindo que o pellet celular permaneça intacto. Ressuspenda o pellet celular em meio parasita. Calcule a quantidade de meio, dependendo da confluência das células e do número de inserções de poços necessárias. Pegue 10 microlitros das células ressuspensas. Coloque-os em uma lâmina de contagem de células e conte o número de células.

Determine a densidade celular e semeie 300.000 células por inserção em 1 mililitro de meio parasita no lado luminal das inserções do poço. Cultive astrócitos humanos primários usando o meio astrócitos, contendo 2% de FBS, conforme descrito no manuscrito do texto. Determine a densidade celular e semeie 300.000 células por poço no fundo das placas de 6 poços de cultura de tecidos. Cubra a placa para evitar a evaporação e incube durante a noite.

Retire as placas de 6 poços de cultura de tecidos contendo astrócitos nas inserções de poços contendo pericitos da incubadora. Aspire o meio de astrócitos das placas de 6 poços de cultura de tecidos e adicione 1 mililitro de meio parasita e 1 mililitro de meio de astrócitos a cada poço.

Aspire o meio pericito das inserções do poço e coloque-o nas placas de 6 poços de cultura de tecidos contendo os astrócitos semeados. Semear HBMEC a uma densidade de 300.000 células por poço em 2 mililitros de meio clássico completo no lado apical das mesmas inserções de poço.