Um método para bioimpressão 3D de astrócitos corticais murinos

Pegue uma suspensão de astrócitos.

Adicione uma solução de bioink contendo gelatina, derivados de gelatina fotoreticuláveis, fotoiniciadores, fibrinogênio e laminina.

Transfira a suspensão para uma seringa com uma agulha romba.

Resfrie a seringa para gelificação de bioink. Conecte a seringa ao cabeçote de impressão da bioimpressora.

Posicione a agulha adequadamente na placa de cultura. Inicie a bioimpressão com os parâmetros definidos e o design.

A biotinta contendo astrócitos é empurrada para fora da agulha e é depositada em camadas na placa, formando uma estrutura tridimensional com astrócitos presos.

Exponha a construção bioimpressa à luz ultravioleta. O fotoiniciador auxilia na reticulação de derivados da gelatina, aumentando a estabilidade da bioconstrução.

Trate com trombina e íons de cálcio.

A trombina, com íons de cálcio, converte o fibrinogênio em fibrina, formando-se em uma rede de biopolímeros 3D estável.

Descarte a solução e lave com tampão para remover os agentes de reticulação.

Adicione meios de astrócitos e incuba. A laminina auxilia na adesão e disseminação dos astrócitos, formando um tecido neural 3D rico em astrócitos.

Para obter uma concentração final de 1 x 10⁶ células por mililitro, transfira 1 mililitro de solução de gelatina-gelatina-metacriloílo-fibrinogênio para o tubo que contém as células e homogeneize pipetando suavemente para cima e para baixo. Use uma pipeta de 1000 microlitros para transferir lentamente os astrócitos colocados na solução de biotinta de gelatina-gelatina-metacriloílo-fibrinogênio para uma seringa de plástico de 5 mililitros, evitando a formação de bolhas. Conecte uma agulha romba estéril de calibre 22 à seringa.

Exponha a bioimpressora à luz ultravioleta por 15 minutos e, em seguida, limpe a bioimpressora com etanol a 70%. Em seguida, conecte a seringa ao cabeçote de impressão da bioimpressora e lave manualmente a biotinta para remover as bolhas restantes.

Para realizar a bioimpressão, coloque uma placa de cultura de 35 milímetros na mesa da bioimpressora. Posicione a agulha a 0,1 milímetros de distância da superfície da placa de cultura para permitir o movimento da agulha e pressione o botão Imprimir. Quando a bioimpressão terminar, certifique-se de que a seringa se afaste do prato e feche o prato de cultura. Coloque a placa de cultura sob luz ultravioleta para reticulação de gelatina-metacriloil.

Use uma espátula estéril para transferir a construção bioimpressa para uma placa de 24 poços, adicione 500 microlitros de solução de cloreto de cálcio trombina e deixe por 30 minutos para permitir a reticulação da fibrina. Depois de remover a solução de reticulação, lave a construção com 2 mililitros de PBS. Em seguida, substitua o PBS por 1 mililitro de meio de cultura de astrócitos. Incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e troque o meio a cada três dias.