Um hidrogel à base de ácido hialurônico para cultura tridimensional de células de glioblastoma

Comece com gliomaspheres, agregados celulares derivados de um tumor cerebral ou glioblastoma.

Adicione enzimas de dissociação. Incubar para separar as células do glioblastoma e obter uma suspensão unicelular.

Em seguida, introduza um meio de cultura enriquecido com soro para interromper a atividade enzimática.

Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células.

Filtrar a suspensão, centrifugar e retirar o sobrenadante.

Ressuspenda as células em precursores de hidrogel que contêm pequenos peptídeos.

Carregue esta mistura em poços com um molde de silicone pré-montado contendo ácido hialurônico.

Misture a solução. Incubar para permitir a interação entre o ácido hialurônico e os precursores do hidrogel, formando um hidrogel que facilita o aprisionamento celular.

Cubra o hidrogel com meios de cultura para sustentar a sobrevivência celular.

Depois de desmontar o molde, incube o hidrogel.

Dentro do hidrogel, as proteínas de adesão nas células interagem com os peptídeos precursores e o ácido hialurônico.

Isso faz com que as células formem pequenos aglomerados e desenvolvam uma cultura tridimensional.

Para começar, coloque moldes de borracha de silicone limpos e secos em cada poço de uma placa de 12 poços não tratada com cultura de tecidos e use a extremidade romba limpa de uma ponta de pipeta para aderir os moldes ao fundo da placa. Depois de verificar a vedação entre os moldes e o fundo do poço, colete as esferas de glioma dissociadas de uma cultura de células de glioblastoma por centrifugação e ressuspenda o pellet em um mililitro de enzima de dissociação celular.

Após cinco minutos à temperatura ambiente, agite o tubo com batidas suaves e interrompa a reação enzimática com quatro mililitros de meio completo. Centrifugue novamente as células e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo fresco antes de coar as células através de um filtro de 70 micrômetros. Lave o filtro com mais quatro mililitros de meio completo e divida a suspensão em duas alíquotas de 8 x 10⁴ células por tubo de centrífuga.

Colete as células por centrifugação e ressuspenda um pellet em 80 microlitros de maleimida de polietilenoglicol recém-preparado, ou PEG-Mal-RGD, e um pellet em 80 microlitros de solução PEG-Mal-CYS recém-preparada por molde. Usando uma ponta de micropipeta de orifício largo de 200 microlitros, adicione 40 microlitros de solução de ácido hialurônico em cada molde de silicone de borracha, seguido por 40 microlitros da solução de célula PEG-Mal-CYS ou PEG-Mal-RGD, pipetando rapidamente para cima e para baixo não mais do que 10 vezes por molde para misturar.

Devido ao rápido tempo de gelificação, uma vez que os dois componentes do hidrogel são misturados, é importante usar uma ponta de pipeta de orifício largo para misturar as soluções de forma rápida, mas completa. Esta etapa requer prática.

Em seguida, coloque as células encapsuladas em gel em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius e 5% de CO₂ por 5 a 10 minutos. No final da incubação, adicione 2 a 2,5 mililitros de meio de cultura a cada gel e use uma ponta de pipeta estéril de dois microlitros e uma pinça para separar suavemente os géis das laterais dos moldes. Em seguida, use uma pinça esterilizada para remover os moldes dos poços da placa e retorne a placa à incubadora de células.