JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 5:12 min • July 8th, 2025
Comece com um cérebro de filhote de rato.
Isole o cerebelo e obtenha fatias de tecido de espessura adequada.
Transfira as fatias para inserções de membrana colocadas dentro de poços de placa de cultura contendo meio.
Em poços tratados, o meio contém um composto de teste neuroprotetor. Os poços de controle não têm o composto. Incubar.
Sob condições de controle, as células cerebelares de Purkinje sofrem apoptose, mimetizando o desenvolvimento pós-natal precoce in vivo.
Em poços tratados, dependendo de seu potencial, o composto pode proteger as células da apoptose.
Lave as fatias e fixe-as para preservar a integridade celular.
Transfira as fatias para uma solução de bloqueio de permeabilização para permeabilizar as membranas celulares e bloquear locais de ligação não específicos.
Sobreposição com anticorpos primários direcionados a uma proteína de ligação ao cálcio especificamente expressa em células de Purkinje.
Lave e introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários.
Contra-core os núcleos com um corante de ligação ao DNA e monte as fatias.
Usando um microscópio confocal, quantifique as células de Purkinje viáveis para identificar o potencial neuroprotetor do composto de teste
Para colher o cerebelo, use uma pinça reta para segurar a cabeça do filhote pelo nariz e use uma tesoura reta para abrir o couro cabeludo da extremidade posterior lateralmente à linha média. Corte o crânio da mesma maneira, apontando as pontas da tesoura para fora para evitar danificar o cerebelo, e use uma espátula para transferir o cérebro para um prato de 60 milímetros contendo HBSS frio e 5 miligramas por mililitro de glicose.
Use a pinça de curativo reto para dissecar cuidadosamente o cerebelo e use uma pinça fina curva estéril para colocar o tecido em um disco de plástico na mesa de corte de um picador de tecido. Gire a mesa de corte para orientar o tecido para permitir a aquisição de seções parassais e puxe o botão de liberação da mesa para a direita para mover a mesa de corte até que a lâmina esteja posicionada na borda do tecido. Em seguida, ajuste a espessura da fatia para 350 micrômetros e a velocidade da lâmina para média e inicie o picador. Quando todo o cerebelo tiver sido cortado, desligue o picador.
Usando uma pinça estéril, segure o disco sobre um novo prato de 60 milímetros. Use uma pipeta de transferência para liberar HBSS mais glicose sobre o disco para que as fatias caiam no prato. Em seguida, tocando as amostras o mínimo possível, use uma microssonda para separar as fatias.
Use a pipeta de transferência para selecionar as seções do cerebelo próximas ao vérmis em inserções de cultura de células individuais na placa de seis poços e use a microssonda para posicionar as fatias no centro de cada inserção. Quando todas as fatias tiverem sido colocadas, aspire cuidadosamente qualquer excesso de HBSS mais glicose e retorne a placa à incubadora de cultura de células.
Para coloração de imunofluorescência, remova o sobrenadante de cada poço e lave as inserções com PBS. Fixe as fatias com 1 mililitro de paraformaldeído frio a 4% no poço de cada inserto e 500 microlitros em cima de cada inserto por 1 hora.
No final da fixação, lave as pastilhas quatro vezes por 10 minutos com 1 mililitro de PBS fresco sob cada pastilha e 500 microlitros de PBS fresco em cima de cada pastilha por lavagem em um agitador orbital. Encha previamente cada poço de uma placa de 24 poços com 500 microlitros de PBS-TB e use um pincel para transferir as fatias cerebelares de cada inserção de cultura de células para poços individuais de uma placa de 24 poços.
Permeabilize e bloqueie as fatias em temperatura ambiente por uma hora. No final da incubação, rotule as células com 200 microlitros do anticorpo primário de interesse diluído em PBS-TB por poço durante a noite a 4 graus Celsius no agitador orbital.
Na manhã seguinte, lave as fatias quatro vezes por 10 minutos e 500 microlitros de PBS fresco por lavagem no shaker antes de rotular as amostras com os anticorpos secundários conjugados com fluoróforo apropriados por duas horas em temperatura ambiente no shaker protegido da luz.
No final da incubação, contra-core as seções com 500 microlitros de uma coloração nuclear apropriada por poço por 10 minutos em temperatura ambiente protegida da luz e use uma pipeta de transferência para montar as fatias em lâminas de vidro.
Em seguida, deixe as seções secarem completamente antes de reidratar com PBS e montar os tecidos com lamínulas revestidas com aproximadamente 80 microlitros de meio de montagem. Uma vez que o meio de montagem tenha curado, as seções cerebelares estão prontas para serem fotografadas.