Uma técnica para gerar uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

Comece com colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos cultivadas em uma matriz de membrana basal aderente.

Adicione um meio de diferenciação cerebelar contendo um hormônio específico, fator de crescimento e inibidores de moléculas pequenas.

Levante as colônias usando uma pipeta de vidro e transfira-as para uma placa de fixação ultrabaixa.

A superfície de baixa inserção mantém as células em suspensão, facilitando sua agregação em corpos embrióides tridimensionais, ou EBs.

O hormônio, o fator de crescimento e os inibidores se ligam aos seus respectivos locais-alvo, promovendo a diferenciação das células-tronco em progenitores neuronais.

Transfira os EBs para poços de placa de cultura revestidos com um polímero sintético e uma proteína de adesão para facilitar a fixação do EB.

Substitua o meio por um meio de diferenciação sem inibidores.

As células começam a migrar para fora dos EBs, formando uma monocamada 2D.

Remova o meio e adicione um meio de maturação cerebelar.

Os fatores de crescimento no meio induzem a maturação de progenitores neuronais em precursores neuronais cerebelares distintos.

No dia zero, adicione 1 mililitro de meio de diferenciação cerebelar suplementado com 10 micromolares Y27632 e SB431542 a cada poço de um acessório ultrabaixo de seis poços ou placa ULA e coloque-o na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços. Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxado. Aspirar o meio e adicionar 1 mililitro de solução de passagem de iPSC para cada prato de 35 milímetros.

Após três minutos de incubação a 37 graus Celsius, aspirar o meio e adicionar 2 mililitros de meio de diferenciação cerebelar suplementado com 10 micromolares Y27632 e SB431542. Sob ampliação de 4X de um microscópio invertido de luz transmitida, levante as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada. Assim que cada colônia for levantada, transfira suavemente todas as colônias para um poço da placa ULA de 6 poços usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Repita esse processo para cada placa iPSC e incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

No dia 2, adicione FGF2 a cada poço para ajustar uma concentração final de 50 nanogramas por mililitro. No dia 7, troque um terço do meio aspirando 1 mililitro de meio gasto e substituindo-o por 1 mililitro de meio de diferenciação cerebelar fresco. Incubar os corpos embrióides por sete dias.

No dia 14, gire a placa para reunir todos os corpos embrióides no centro da placa. Em seguida, incline a placa e aspire todo o meio gasto usando um pipetador de 1000 microlitros pela borda. À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar, deixando meio suficiente para evitar o ressecamento dos corpos embrióides.

Em seguida, adicione 3 mililitros de meio de diferenciação cerebelar fresco suplementado com 10 micromolares. Y27632. Em seguida, transferir os corpos embrióides utilizando uma pipeta serológica de 10 mililitros para uma placa revestida com poli-L-Ornitina laminada. No dia 15, aspirar o meio e substituí-lo por meio de diferenciação cerebelar fresco.