Cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do tecido cerebral embrionário de camundongos

Trate o tecido embrionário do mesencéfalo, rico em neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento, com uma solução de tripsina-EDTA para separá-los da matriz tecidual.

Adicione um meio de desativação para inibir a atividade enzimática e, em seguida, lave para remover as enzimas residuais.

Pipete o tecido repetidamente. Os neurônios embrionários possuem menos projeções, reduzindo o estresse durante esse distúrbio e gerando uma suspensão unicelular.

Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda os neurônios em um meio completo. Transfira esses neurônios para uma lamínula revestida de polímero para fixação celular.

Coloque a lamínula em uma placa de vários poços com um meio completo, fornecendo nutrientes e fatores de crescimento essenciais para o crescimento dos neurônios.

Os antibióticos no meio impedem o crescimento bacteriano, apoiando a viabilidade neuronal.

À medida que os neurônios crescem e amadurecem, eles desenvolvem projeções celulares, como axônios e dendritos, formando conexões sinápticas.

Periodicamente, remova metade da mídia usada para eliminar subprodutos tóxicos.

Adicione um meio fresco para a manutenção a longo prazo dos neurônios dopaminérgicos.

Sob um capuz, remova o HBSS da coleção do mesencéfalo ventral. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina-EDTA a 0,05% quente, solução suficiente para 12 pedaços de tecido. Incube o tecido a 37 graus Celsius por 5 a 10 minutos. Sob o capô, substitua a tripsina-EDTA por 1 mililitro de meio de desativação.

Agite suavemente a mistura e, em seguida, remova o meio de desativação, mas deixe meio suficiente para trás para que as células dissociadas não sejam descartadas. Em seguida, lave os tecidos com meio completo duas vezes sem perder as células. Agora, adicione 1 mililitro de meio completo. Em seguida, triturar o tecido com a pipeta polida a fogo, sem formar bolhas até obter uma suspensão unicelular. Cerca de 8 a 10 passes devem ser suficientes.

Após a trituração, centrifugue as células de 400 g's por 5 minutos. Remova o meio e ressuspenda as células em 1 mililitro de meio completo. Pipete as células até 4 vezes para obter uma suspensão. Comece contando e avaliando a saúde das células da suspensão usando exclusão de azul de tripano com um hemocitômetro.

Agora, ajuste a suspensão celular para 1.500 células por microlitro. Em seguida, transfira as tampas dos tubos de microcentrífuga esterilizados para pratos de 100 milímetros. Coloque as lamínulas preparadas nas tampas usando uma pinça. Não lave as lamínulas e tente não deixá-las secar. Carregue 100 microlitros de suspensão em cada lamínula.

Este método um tanto incomum fornece 90% de viabilidade de cultura e é um passo crítico para o sucesso. Em seguida, feche a placa de Petri e transfira-a para a incubadora por uma hora. Após a incubação, transfira cuidadosamente as lamínulas com as placas de médio a 24 poços, contendo 400 microlitros de meio completo aquecido a 37 graus Celsius em cada poço. Em seguida, incube as células durante a noite.

As primeiras horas são as mais críticas para a sobrevivência celular. Dentro de 24 horas, adicione delicadamente meio mililitro de meio completo a cada poço. A cada 2 semanas, troque metade da mídia. Se a cultura ficar amarela, a troca de meio meio pode ser realizada mais cedo, mas a mudança ainda deve ser pouco frequente. Os neurônios dopaminérgicos sobreviverão por mais de 6 semanas nessas condições.