Cultura e manutenção de neurônios dopaminérgicos do tecido cerebral embrionário de camundongos
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 4:22 min • July 8th, 2025
Trate o tecido embrionário do mesencéfalo, rico em neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento, com uma solução de tripsina-EDTA para separá-los da matriz tecidual.
Adicione um meio de desativação para inibir a atividade enzimática e, em seguida, lave para remover as enzimas residuais.
Pipete o tecido repetidamente. Os neurônios embrionários possuem menos projeções, reduzindo o estresse durante esse distúrbio e gerando uma suspensão unicelular.
Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda os neurônios em um meio completo. Transfira esses neurônios para uma lamínula revestida de polímero para fixação celular.
Coloque a lamínula em uma placa de vários poços com um meio completo, fornecendo nutrientes e fatores de crescimento essenciais para o crescimento dos neurônios.
Os antibióticos no meio impedem o crescimento bacteriano, apoiando a viabilidade neuronal.
À medida que os neurônios crescem e amadurecem, eles desenvolvem projeções celulares, como axônios e dendritos, formando conexões sinápticas.
Periodicamente, remova metade da mídia usada para eliminar subprodutos tóxicos.
Adicione um meio fresco para a manutenção a longo prazo dos neurônios dopaminérgicos.
Sob um capuz, remova o HBSS da coleção do mesencéfalo ventral. Em seguida, adicione um mililitro de tripsina-EDTA a 0,05% quente, solução suficiente para 12 pedaços de tecido. Incube o tecido a 37 graus Celsius por 5 a 10 minutos. Sob o capô, substitua a tripsina-EDTA por 1 mililitro de meio de desativação.
Agite suavemente a mistura e, em seguida, remova o meio de desativação, mas deixe meio suficiente para trás para que as células dissociadas não sejam descartadas. Em seguida, lave os tecidos com meio completo duas vezes sem perder as células. Agora, adicione 1 mililitro de meio completo. Em seguida, triturar o tecido com a pipeta polida a fogo, sem formar bolhas até obter uma suspensão unicelular. Cerca de 8 a 10 passes devem ser suficientes.
Após a trituração, centrifugue as células de 400 g's por 5 minutos. Remova o meio e ressuspenda as células em 1 mililitro de meio completo. Pipete as células até 4 vezes para obter uma suspensão. Comece contando e avaliando a saúde das células da suspensão usando exclusão de azul de tripano com um hemocitômetro.
Agora, ajuste a suspensão celular para 1.500 células por microlitro. Em seguida, transfira as tampas dos tubos de microcentrífuga esterilizados para pratos de 100 milímetros. Coloque as lamínulas preparadas nas tampas usando uma pinça. Não lave as lamínulas e tente não deixá-las secar. Carregue 100 microlitros de suspensão em cada lamínula.
Este método um tanto incomum fornece 90% de viabilidade de cultura e é um passo crítico para o sucesso. Em seguida, feche a placa de Petri e transfira-a para a incubadora por uma hora. Após a incubação, transfira cuidadosamente as lamínulas com as placas de médio a 24 poços, contendo 400 microlitros de meio completo aquecido a 37 graus Celsius em cada poço. Em seguida, incube as células durante a noite.
As primeiras horas são as mais críticas para a sobrevivência celular. Dentro de 24 horas, adicione delicadamente meio mililitro de meio completo a cada poço. A cada 2 semanas, troque metade da mídia. Se a cultura ficar amarela, a troca de meio meio pode ser realizada mais cedo, mas a mudança ainda deve ser pouco frequente. Os neurônios dopaminérgicos sobreviverão por mais de 6 semanas nessas condições.
Visão Geral
Este artigo detalha um protocolo para o isolamento de neurônios dopaminérgicos a partir de tecido mesencefálico embrionário. O método enfatiza a importância de manter a viabilidade celular e promover o crescimento neuronal por meio de manipulação cuidadosa e gerenciamento adequado do meio de cultura.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- Os neurônios dopaminérgicos são cruciais para diversas funções neurológicas.
- As técnicas de isolamento são essenciais para o estudo do comportamento e das propriedades neuronais.
- A manutenção da viabilidade celular é fundamental para um cultivo neuronal bem-sucedido.
- O tecido mesencefálico embrionário é rico em neurônios dopaminérgicos em desenvolvimento.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para o isolamento de neurônios dopaminérgicos.
- Garantir alta viabilidade e crescimento de neurônios cultivados.
- Facilitar pesquisas futuras sobre as funções dos neurônios dopaminérgicos.
Métodos Utilizados
- Tratamento de tecido mesencefálico embrionário com tripsina-EDTA para desanexação celular.
- Uso de um meio de desativação para inibir a atividade enzimática.
- Lavagem e re-suspensão de neurônios em meio completo.
- Substituições cuidadosas do meio para manter condições ideais de crescimento.
Principais Resultados
- Geração bem-sucedida de uma suspensão de células isoladas a partir de tecido do mesencéfalo.
- Viabilidade elevada em cultura obtida por meio de manipulação cuidadosa.
- Os neurônios desenvolveram projeções celulares e formaram conexões sinápticas.
- Manutenção de longo prazo de neurônios dopaminérgicos demonstrada.
Conclusões
- O método descrito é eficaz para o isolamento e cultivo de neurônios dopaminérgicos.
- O manejo adequado do meio de cultura é crucial para a saúde neuronal.
- Este protocolo pode auxiliar no avanço da pesquisa sobre as funções dos neurônios dopaminérgicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de culturas confiáveis de neurônios dopaminérgicos permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos para a doença de Parkinson e no desenvolvimento de ensaios. Este método apoia a triagem fenotípica ao fornecer um sistema relevante para a doença, no qual se avaliam os efeitos de compostos sobre a sobrevivência e a função neuronal. A capacidade de manutenção a longo prazo facilita o desenvolvimento de modelos pré-clínicos e estudos translacionais de biomarcadores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias de sobrevivência de neurônios dopaminérgicos e o engajamento de alvos em um contexto fisiologicamente relevante.
- Valor Operacional: Fornece um sistema padronizado para avaliar a modulação de alvos e leituras funcionais.
- Valor Preditivo: Apoia a testagem de hipóteses e a redução de riscos biológicos antes dos esforços de identificação de compostos líderes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera saídas quantificáveis, como o crescimento de neuritos e a formação sináptica, para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Permite plaqueamento e gerenciamento de meios reprodutíveis, compatíveis com triagem de alto conteúdo.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de múltiplos poços para avaliações de resposta à dose e de curso temporal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Oferece um sistema de neurônios primários modelando mecanismos de degeneração dopaminérgica.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica por meio de fenótipos neuronais consistentes.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de avançar ou interromper com base em perfis neuroprotetores ou toxicológicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método posiciona-se na fase inicial da descoberta para permitir a validação do alvo, prossegue para triagem na identificação de compostos líderes e apoia a avaliação pré-clínica por meio de culturas neuronais sustentadas.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre vias dopaminérgicas e a clarificação de alvos em neurônios derivados do mesencéfalo embrionário.
- Triagem: Fornece culturas prontas para ensaios com limiares definidos de viabilidade e densidades de semeadura reprodutíveis.
- Análises: Permite a medição quantitativa de projeções celulares, marcadores sinápticos e ensaios de viabilidade para comparações entre condições.
- Pesquisa Translacional: Mantém fenótipos neuronais relevantes para doenças por até seis semanas, garantindo continuidade pré-clínica.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalonável de cultura neuronal aplicável em múltiplas campanhas de descoberta.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio de modelos neuronais fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de dissociação, semeadura e troca de meio.
- Valor Estratégico: Reduz a eliminação em estágios avançados ao melhorar a confiança preditiva na triagem neurofarmacológica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em dados de sobrevivência de neurônios dopaminérgicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecido neuronal primário e técnicas estéreis de cultivo celular.
- Depende do acesso à tripsina-EDTA, meio de desativação, superfícies revestidas com polímero e incubadoras de CO2.
- Necessita treinamento padronizado para procedimentos consistentes de trituração e contagem celular.
- Envolve considerações de adaptação ao ser traduzido para neurônios dopaminérgicos derivados de iPSCs humanos.
- Limitado pela vida útil finita de culturas primárias, exigindo pontos finais experimentais cronometrados.
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Última atualização: 29 agosto 2026