Isolando e Cultivando Progenitores de Neurônios Granulares Cerebelares Murinos

Pegue o filhote de rato cerebella.

Homogeneize-os em fragmentos menores.

Adicione uma enzima proteolítica para digerir a matriz extracelular do tecido, soltando os progenitores granulares cerebelares, ou CGNPs, e os astrócitos.

Adicione meios de cultura CGNP contendo soro para interromper a atividade enzimática. Centrifugue e descarte o sobrenadante rico em enzimas.

Ressuspenda os fragmentos de tecido em meio CGNP. Dissocie mecanicamente o tecido para liberar as células.

Assim que os detritos assentarem, transfira o sobrenadante contendo as células para um novo tubo.

Centrifugue e remova o sobrenadante com detritos.

Ressuspenda as células em meio CGNP e semeie-as em poços de placas de vários poços revestidos com poli-D-lisina. Incubar.

Os astrócitos se depositam e aderem fortemente ao revestimento de poli-D-lisina, em comparação com os CGNPs.

Agitar a placa e recolher o sobrenadante que contém CGNP. Centrifugar e retirar o sobrenadante.

Ressuspenda os CGNPs em meio CGNP e semeie-os em uma placa multipoços revestida com poli-L-ornitina. Incubar.

Os CGNPs se ligam à superfície revestida e proliferam, auxiliados pelos componentes do meio e pela poli-L-ornitina.

Transfira de três a cinco cerebelos para tubos de 15 mililitros. Lave o cerebelo com glicose HBSS antes da centrifugação. Centrifugue os tubos para coletar o tecido. Após a lavagem final, homogeneizar o cerebelo pipetando suavemente para cima e para baixo duas a três vezes com uma pipeta de 1 mililitro até que os fragmentos tenham 0,5 a 1 milímetro cúbico de tamanho.

Remova suavemente todo o líquido até que restem 2,5 mililitros. Em seguida, adicione tripsina a 0,05% no tubo com glicose HBSS contendo o cerebelo e incube o tecido em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos. Inverta o tecido a cada 1 a 3 minutos. Após a incubação, interrompa a digestão adicionando 5 mililitros de meio de cultura de células cGMP ou CGM e colete o tecido por centrifugação como antes.

Após centrifugação, remova o sobrenadante e adicione 1 mililitro CGM. Triturar o tecido com a ponta da pipeta de 1 mililitro, evitando a formação de bolhas de ar. Em seguida, adicione 5 mililitros de CGM e incube a mistura por dois minutos no gelo para assentar os restos de tecido. Assim que o tecido assentar, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, adicione 2 mililitros de CGM ao tecido residual e repita o procedimento de trituração antes de colher o sobrenadante e descartar os restos de tecido.

Agrupe os sobrenadantes de cada tubo de tecido de 15 mililitros e centrifugue para coletar as células cerebelares. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de CGM. Como os astrócitos aderem mais rápido e mais forte à poli-D-lisina do que aos cGMPs, adicione até 4 mililitros de suspensão celular aos poços de placas de 6 poços revestidas com poli-D-lisina e incube por 20 minutos a 37 graus Celsius para remover os astrócitos.

Agite o prato. Recolher o sobrenadante num tubo de 15 mililitros e, em seguida, centrifugar o sobrenadante como antes. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de CGM e conte as células com uma câmara de contagem de Neubauer. Após 4 a 6 horas, os cGMPs aderidos aparecem redondos e são proliferativos. Semeie as células em CGM em placas revestidas com poli-L-ornitina e incube a 37 graus Celsius, 5% de CO₂ e 100% de umidade relativa.