JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:00 min • July 8th, 2025
Comece com colônias de células-tronco pluripotentes humanas ou hPSCs ligadas a um substrato adequado em um meio de cultura.
Remova o meio. Adicione um meio neuronal contendo inibidores específicos e incuba.
Esses inibidores direcionam a maturação das hPSCs para uma linhagem neuronal, formando colônias neuroectodérmicas. Estes são precursores de pequenas estruturas esféricas chamadas esferóides.
Remova o meio e lave com um tampão de sal.
Incube com uma enzima digestiva para separar as colônias da placa.
Adicione o meio neuronal para interromper a atividade enzimática.
Colete as colônias e transfira-as para um tubo.
Deixe-os assentar e, em seguida, descarte o sobrenadante.
Ressuspenda as colônias em um meio neuronal contendo um fator de crescimento.
Transfira as colônias para uma placa de vários poços e incuba.
Esse fator de crescimento facilita a auto-organização e multiplicação das células neuroectodérmicas, levando-as a formar um esferóide.
Para começar, coloque as colônias de hPSC em uma matriz de membrana basal qualificada para hESC de um poço de uma placa de 6 poços com 60% de confluência em três poços para atingir 20% a 30% de densidade e, em seguida, prossiga com a indução de colônias neuroectodérmicas 2D.
Adicione meio N2 fresco suplementado com inibidores duplos de SMAD diariamente em cada poço pelos próximos 3 dias. Para gerar esferoides neuroectodérmicos 3D a partir de colônias neuroectodérmicas 2D induzidas, remova 2 mililitros de meio N2 da placa de 6 poços e lave uma vez com HBSS para garantir que todo o meio N2 seja removido.
Adicione 1 mililitro de dispase a cada poço contendo colônia. Incube a placa por 20 a 25 minutos a 37 graus Celsius e verifique regularmente o desprendimento da colônia. No final da incubação, para interromper a atividade da enzima dispase, adicione 1 mililitro de meio N2 ao poço. Usando uma ponta de pipeta P1000 de diâmetro largo ou um copo de ponta de pipeta P1000 modificado com tesoura estéril, transfira as colônias para um tubo de 15 mililitros e permita que os aglomerados de colônias afundem no fundo do tubo com gravidade.
Em seguida, com uma ponta de pipeta P1000 padrão, remova cuidadosamente o sobrenadante. Substitua-o por 1 mililitro de meio N2 fresco e repita a lavagem três vezes para garantir a remoção completa do dispase. Depois de ressuspender os aglomerados de células e o meio N2, transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de 6 poços e adicione 40 nanogramas por mililitro de bFGF.