JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:49 min • July 8th, 2025
Comece com um músculo da cabeça de rato e corte-o em fragmentos.
Adicione um coquetel de enzimas proteolíticas e incube com agitação suave.
As enzimas digerem a matriz extracelular do tecido, afrouxando as fibras musculares.
Adicione meios contendo proteínas séricas para inativar as enzimas.
Transfira o tecido para um tubo, centrifugue e descarte o sobrenadante.
Ressuspenda o tecido em meio. Repita a interrupção mecânica e a centrifugação duas vezes para obter uma suspensão homogênea de células satélites - células-tronco cruciais para o reparo e regeneração muscular.
Colete o sobrenadante contendo células satélites.
Passe por um filtro de célula para obter uma suspensão de célula única. Centrifugue, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células no meio.
Coloque gotas da suspensão celular em poços de lâmina de câmara revestidos de proteína de matriz extracelular.
A superfície revestida facilita a fixação das células satélites. Adicione mídia aos poços.
Os fatores de crescimento no meio induzem a proliferação e diferenciação de células satélites em mioblastos - precursores de células musculares, que proliferam e se fundem para formar miotubos multinucleados.
Os miotubos eventualmente amadurecem em fibras musculares.
Para isolar as células satélites, transfira cada músculo para poços individuais de uma placa de seis poços e corte os tecidos em pequenos pedaços de 2 milímetros, tomando cuidado para não picar muito os músculos. Em seguida, incube cuidadosamente os fragmentos de tecido em 2,5 mililitros de solução de pronase a 0,1% por poço a 37 graus Celsius por 60 minutos, com agitação suave, a cada 20 minutos.
Quando os feixes de fibras exibirem uma aparência solta, adicione 2,5 mililitros de DMEM, suplementado com soro de cavalo e antibióticos em cada poço, e transfira os tecidos digeridos para tubos cônicos individuais de 15 mililitros. Gire as pastas de tecido e decanta os sobrenadantes. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio a cada tubo e homogeneize o tecido com uma pipeta de plástico de 10 mililitros.
Gire os tecidos novamente e transfira os sobrenadantes para novos tubos cônicos de 15 mililitros. Em seguida, adicione mais 5 mililitros de meio aos tubos e triture os pedaços de tecido novamente até que os fragmentos passem facilmente pela pipeta.
Após outra centrifugação, agrupar os sobrenadantes nos tubos correspondentes apropriados e filtrar as suspensões celulares através de filtros de 40 micrômetros em tubos individuais de 50 mililitros. Lave os filtros com 1 mililitro de DMEM para recuperação celular máxima. Em seguida, gire as células. Ressuspenda os pellets em meio fresco e conte as células.
Para cultivar as células satélites isoladas, em seguida, diluir as suspensões celulares para 1,5 x 103 células por 10 microlitros de meio de cultura. Em seguida, adicione 10 microlitros de células em cada ponto de gel de matriz extracelular previamente preparado e incube os géis a 37 graus Celsius. Após seis horas, adicione cuidadosamente 400 microlitros de meio de cultura a cada mancha de gel e devolva as lâminas à incubadora. Após três dias, iniciar a diferenciação das células com a adição do meio de cultura apropriado.