Neurogênese induzida por ácido retinóico usando células de carcinoma embrionário de camundongo

Pegue uma suspensão de células de carcinoma embrionário de camundongo capaz de se diferenciar em vários tipos de células.

Células de sementes em uma placa de cultura hidrofóbica contendo meio e ácido retinóico.

incubar. As superfícies hidrofóbicas impedem a adesão celular, fazendo com que as células formem agregados.

O ácido retinóico entra nos agregados celulares, desencadeando vias de sinalização e causando diferenciação em células progenitoras neuronais.

Após a incubação, coletar os agregados celulares.

Descarte a mídia.

Adicione meios contendo ácido retinóico e semeie os agregados em uma placa de cultura hidrofóbica.

incubar. O ácido retinóico facilita a diferenciação celular sustentada em neurônios.

Colete os agregados e remova a mídia.

Adicione uma enzima proteolítica para interromper as aderências célula-célula dentro dos agregados.

Adicione meios contendo soro para interromper a atividade enzimática.

Dissociar mecanicamente os agregados, formando uma suspensão neuronal.

Centrifugue e descarte o sobrenadante rico em enzimas.

Ressuspenda os neurônios no meio e semeie-os em uma placa aderente de vários poços contendo meio.

incubar. Os neurônios aderem à placa e amadurecem, estendendo longas projeções.

Para geração de agregados, comece adicionando 10 mililitros de meio de diferenciação suplementado com 5 microlitros de RA a uma placa de cultura não tratada de 100 mililitros. Semeie 1 milhão de células na placa de cultura e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias para promover a formação de agregados.

Após a incubação, com uma pipeta de 10 mililitros, aspirar o meio contendo os agregados e transferi-lo para um tubo de 15 mililitros à temperatura ambiente. Aguarde 1,5 minutos para que os agregados se assentem no fundo e, em seguida, descarte o sobrenadante.

Adicione 10 mililitros de meio de diferenciação fresco suplementado com 0,5 RA micromolar. Semeie delicadamente os agregados em uma nova placa de cultura não tratada de 100 milímetros e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias.

Para começar, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir os agregados celulares para um tubo de 15 mililitros. Aguarde 1,5 minutos à temperatura ambiente para que os agregados se depositem no fundo e, em seguida, descarte o sobrenadante. Lave os agregados com soro e DMEM sem antibióticos. Aguarde até que os agregados de células se estabeleçam na parte inferior. Descarte o sobrenadante e adicione 2 mililitros de tripsina EDTA a 0,25%.

Incube o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 10 minutos, batendo a cada dois minutos para manter as células em suspensão. Em seguida, adicione 4 mililitros de meio de manutenção para interromper a atividade da tripsina e pipete para cima e para baixo 20 vezes usando uma pipeta de 1 mililitro.

Por fim, centrifugue as células a 200 vezes g e à temperatura ambiente durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 5 mililitros de meio de manutenção. Use um contador de células para determinar o número da célula e prossiga com o revestimento das células. Para as células da placa, primeiro, adicione 3 mililitros por poço de meio de manutenção a uma placa de cultura de seis poços. Em seguida, semeie as células a uma densidade de 500.000 por poço. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.