Diferenciando células do corpo embrióide em progenitores neurais usando ácido retinóico

Comece com células-tronco embrionárias cultivadas sobre uma camada de células alimentadoras de fibroblastos, que mantêm as células-tronco em seu estado indiferenciado.

Adicione enzimas tripsina e EDTA para interromper a adesão célula a célula e separar as células.

Mais tarde, adicione um meio de cultura enriquecido com soro para interromper a atividade enzimática e transfira a suspensão celular para um tubo.

Centrifugue para coletar as células, remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em um meio contendo ácido retinóico.

Coloque gotículas desta suspensão celular na base de uma placa de cultura não adesiva.

Inverta a base para formar gotas suspensas e posicione-a sobre a tampa do prato de cultura preenchida com um tampão para evitar que as gotículas sequem.

Em gotas suspensas, a gravidade faz com que as células se estabeleçam no fundo, eventualmente agregando-se em estruturas tridimensionais denominadas corpos embrióides.

Além disso, as células absorvem ácido retinóico, que modula várias vias de sinalização intracelular.

Essa modulação estimula a diferenciação de células-tronco em células progenitoras neurais com a capacidade de produzir neurônios.

Comece a formação do corpo embrióide colhendo células-tronco embrionárias com 0,25% de tripsina-EDTA por 2 a 5 minutos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Adicione o meio de Dulbecco modificado de Iscove fresco ou IMDM com 15% de FBS às células de descolamento e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros.

Centrifugue a 160 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro e prepare uma suspensão de 5 x 10⁵ células por mililitro em IMDM com ácido retinóico 0,5 micromolar. Em seguida, use uma pipeta de 8 canais e pontas de 200 microlitros para plaquear gotas de 120 microlitros por placa de Petri de 100 mililitros. Inverta o prato e encha a tampa invertida com PBS para evitar que as gotas penduradas sequem. Cultura a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 3 a 4 dias.