Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:27 min. • July 8th, 2025
Faça culturas aderentes de células precursoras de oligodendrócitos primários, ou OPCs, em um meio de crescimento.
Adicione vetores lentivirais de controle ao poço de controle e vetores de teste, codificando proteínas de sinalização que regulam a mielinização, ao poço de teste e, em seguida, incube.
As células internalizam os vetores e o RNA viral é transcrito reversamente em DNA e incorporado ao genoma do hospedeiro, expressando as proteínas de sinalização nas células de teste.
Introduzir enzimas para separar os OPCs do substrato.
Neutralize as enzimas e centrifugue para remover as enzimas.
Adicione o meio de crescimento e transfira os OPCs para lamínulas dentro de uma microplaca com gânglio da raiz dorsal aderido ou neurônios DRG. Permita que os OPCs se estabilizem.
Encha os poços com o meio de crescimento e incuba. A interação com os neurônios DRG desencadeia a maturação do OPC em oligodendrócitos.
As proteínas de sinalização expressas induzem os oligodendrócitos a formar bainhas de mielina ao redor dos neurônios DRG.
Avalie a formação da bainha de mielina induzida por proteína de sinalização nas células de teste em comparação com as células transduzidas por vetor de controle.
Para este protocolo, possuem células precursoras de oligodendrócitos primários, OPCs, cultivadas em placas de 10 centímetros com 10 mililitros de meio SATO contendo os seguintes fatores de crescimento - CNTF, PDGF, NT3 e Forskolin. As células devem ter sido cultivadas por 24 horas sob 8% de dióxido de carbono.
Comece aspirando a mídia e remova-a completamente. Em seguida, substitua-o por 10 mililitros do mesmo meio com os fatores de crescimento. Infecte seus OPCs com lentivírus, expressando a proteína de interesse, adicionando o volume necessário de vírus gota a gota na mídia.
Além disso, em uma placa OPC separada, misture o lentivírus de controle que expressa apenas GFP no meio. Cultive as células por mais 48 horas e, em seguida, colete os OPCs das placas para semear nos neurônios DRG cultivados.
Primeiro, enxágue cada placa com 8 mililitros de EBSS duas vezes. Completar 1 mililitro de tripsina-EDTA 0,05% com 9 mililitros de EBSS quente. Adicione 5 mililitros de tripsina diluída a cada placa. Incube a 37 graus Celsius por até dois minutos. Neutralize a tripsina adicionando 5 mililitros de 30% de FBS no EBSS.
Em seguida, usando uma pipeta de 10 mililitros, lave os OPCs da superfície da placa. Gire a placa em um quarto de volta a cada vez para coletar todas as células. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue as células à temperatura ambiente durante 15 minutos a 180 g's.
Agora, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio SATO quente sem fatores de crescimento e conte as células. Em seguida, prepare os neurônios DRG que são cultivados nas lamínulas de 22 milímetros, aspirando completamente o meio de sua placa.
Em seguida, semeie suavemente 200.000 OPCs, gota a gota, em cada lamínula. O volume de semeadura deve ser inferior a 200 microlitros por lamínula. Deixe as células assentarem sem mover a placa. Após 10 minutos, cubra cada poço com um mililitro de meio SATO quente. Agora recoloque os OPCs irmãos restantes com meios SATO contendo fatores de crescimento. Eles podem ser usados posteriormente para verificar a expressão da proteína de interesse.