Isolando dobras neurais cranianas de um embrião de pintinho para uma cultura de células da crista neural

Pegue um embrião de pintinho apoiado em uma moldura de papel de filtro e posicione-o sob um microscópio de dissecação.

Remova a membrana vitelina, uma camada protetora ao redor do embrião.

Identifique as dobras neurais do mesencéfalo localizadas posteriormente aos lobos ópticos e anteriores ao crescente cardíaco, o precursor embrionário do coração maduro.

As dobras neurais contêm células da crista neural pré-migratórias, que são células-tronco multipotentes que se transformam em células migratórias durante o desenvolvimento.

Essas células migratórias se diferenciam em células neuronais e não neuronais.

Extirpar o aspecto mais dorsal das pregas neurais e transferir o tecido para uma placa de cultura contendo tampão.

Em seguida, coloque lamínulas revestidas com uma proteína de adesão em poços de placa de cultura contendo meio.

Transfira as dobras neurais para as lamínulas revestidas. Incubar para facilitar a fixação do tecido.

Durante o cultivo, as células migratórias da crista neural emergem das dobras neurais para a superfície revestida, estabelecendo uma cultura de células da crista neural.

Transfira um embrião para um prato limpo contendo a solução de Ringer. Agite suavemente o embrião para frente e para trás para limpar qualquer gema que obscureça a visão e troque a solução de Ringer's Pen-Strep ou transfira-a para um prato fresco se ficar turvo. Posicione o embrião dorsal e com o lado da moldura para cima sob um microscópio de dissecação. Deixe o embrião na moldura de papel para mantê-lo esticado e mantido no lugar.

Em seguida, remova a membrana vitelina usando uma pinça para expor as dobras neurais. Inclua tecido caudal às vesículas ópticas em expansão e rostral ao rombencéfalo, onde as constrições rombomeras estão apenas começando a aparecer. Usando uma tesoura de mola, excise cuidadosamente as dobras neurais do mesencéfalo. Tome cuidado para extirpar o aspecto dorsalmente da prega neural com contaminação mínima do tubo neural e do ectoderma não neural e transfira as dobras neurais para um prato limpo contendo a solução de Ringer's Pen-Strep usando um pipetador P20 ou uma pipeta de vidro estéril de Pasteur enxaguada com solução gema de Ringer's Pen-Strep.

Armazene as dobras coletadas no gelo enquanto disseca as dobras adicionais. Depois de remover a placa de cultura da incubadora, use um pipetador ou pipeta Pasteur para remover a solução de fibronectina da placa ou poço de lamínulas. Depois de enxaguar o substrato revestido com fibronectina com a solução de Ringer, adicione um volume apropriado de meio de cultura completo ao prato ou poço.

Para bloquear o plástico e evitar que o tecido grude, use um pipetador P20 ou P200 e enxágue a ponta da pipeta com solução de Ringer's Pen-Strep gema. Em seguida, transfira as dobras neurais isoladas em direção ao centro da lamínula revestida com fibronectina, tomando cuidado para transferir o mínimo possível de solução de Ringer-Estreptococos. Depois de permitir que os explantes assentem por 10 a 15 minutos, coloque-os em uma câmara umidificada a 38 graus Celsius, carregando lenta e cuidadosamente a placa de cultura com dobras neurais revestidas.