Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:41 min. • July 8th, 2025
Pegue metade da cabeça de um filhote de rato e remova o cérebro.
Corte a parte superior do crânio e excise o tecido circundante para visualizar a cápsula ótica, uma camada externa óssea que protege as estruturas do ouvido interno.
Transfira o tecido para uma placa de cultura contendo um meio tamponado.
Separe os gânglios vestibulares superior e inferior, que contêm os corpos das células nervosas vestibulares.
Raspe a crista óssea e colha o gânglio superior subjacente.
Transferir o gânglio superior para uma nova placa contendo o meio tamponado.
Remova os tecidos aderentes da superfície para limpar o gânglio isolado.
Colocar o gânglio numa solução contendo enzimas proteolíticas.
As enzimas degradam a matriz extracelular do tecido, afrouxando as células.
Transferir o gânglio para uma placa com fundo de vidro revestido a polímero contendo meio de cultura e dissociar mecanicamente o tecido para libertar as células.
Incubar, permitindo que as células adiram e estabeleçam uma cultura de neurônios do gânglio vestibular.
Retire o cérebro do camundongo sacrificado usando uma tesoura cirúrgica fechada. Corte e remova o nervo craniano para separar completamente o cérebro do crânio. Começando na parte de trás da cabeça, retire o material membranoso transparente com uma pinça e, em seguida, corte a parte superior do crânio com uma tesoura cirúrgica.
Remova o excesso de tecido da parte de trás da cabeça e pescoço, para tornar a área de dissecção e a cápsula ótica, mais limpa e de fácil acesso. Transferir o tecido para uma segunda placa de Petri com uma solução fresca de L-15. Em seguida, localize a cápsula ótica e os nervos auditivo, vestibular superior e vestibular inferior. Separe os gânglios superior e inferior usando uma pequena tesoura de mola e corte o nervo auditivo.
Usando um bisturi, raspe suavemente a crista óssea para enfraquecer a área óssea sob a qual o nervo mergulha na cápsula óssea. Remova cuidadosamente os detritos com um bisturi, expondo toda a porção inchada do gânglio.
Use a tesoura de mola fina para cortar e separar o gânglio do ramo nervoso periférico que está mergulhando em direção ao utrículo. Remova o gânglio superior usando uma pinça fina e transfira-o para uma placa de Petri de 35 milímetros com solução fresca de L-15.
Depois de pré-aquecer a solução enzimática, despeje a mistura enzimática em uma placa de Petri de 35 milímetros e coloque-a em uma incubadora de 37 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Limpe o gânglio usando uma pinça fina e uma pequena tesoura de mola, removendo osso, excesso de tecido, fibras nervosas e quaisquer outras estruturas supérfluas. Tome cuidado para minimizar a remoção de qualquer tecido ganglionar.
Transfira os gânglios limpos para a solução enzimática pré-aquecida e coloque-os de volta na incubadora por 10 a 40 minutos. Em seguida, transfira os gânglios para a placa de Petri de 35 milímetros com solução fresca de L-15.
Após dois a três minutos, transfira os gânglios para outra placa de Petri de 35 milímetros cheia de meios de cultura filtrados. Transfira aproximadamente 150 microlitros de meios de cultura filtrados para um prato com fundo de vidro revestido. Em seguida, transfira o número desejado de gânglios para a lamínula.
Retire uma pequena quantidade de meio de cultura da placa de cultura e enxágue a pipeta de trituração com meio para evitar que o tecido grude nas laterais da pipeta de vidro. Triturar passando suave e repetidamente o tecido através da pipeta até que os gânglios estejam suficientemente dissociados.
Após cinco minutos, verifique em um microscópio óptico para ver se as células se acomodaram na lamínula. Coloque cuidadosamente uma placa de cultura em uma incubadora de 37 graus Celsius por 12 a 24 horas.