Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:39 min. • July 8th, 2025
Pegue um córtex de filhote de rato.
Adicione uma enzima proteolítica que digere a matriz extracelular do tecido. Em seguida, dissocie mecanicamente o tecido, soltando as células.
Adicione meios gliais e DNase para degradar qualquer DNA contaminante.
Dissocie mecanicamente o tecido para liberar neurônios e células gliais.
Assim que o tecido não digerido assentar, colete o meio contendo as células e centrifugue. Remova o sobrenadante.
Ressuspenda as células em meio de glia e coloque-as em um frasco revestido de proteína de matriz extracelular.
incubar. Os astrócitos aderem mais fortemente à superfície revestida do que outras células. Os meios gliais promovem apenas a sobrevivência das células gliais.
Substitua a mídia para remover detritos.
Incube com agitação para separar as células precursoras de oligodendrócitos sobrepostas, OPCs e microglia.
Transfira o meio com as células para uma placa de cultura.
Incubar com agitação para facilitar a adesão microglial diferencial.
Transferir o sobrenadante OPC não aderente para uma placa de poli-D-lisina revestida com vários poços. Incubar para adesão ao OPC.
Substitua a mídia por mídia OPC, permitindo o crescimento do OPC.
Adicione 1 mililitro de tripsina a 0,05% com EDTA 0,53 milimolar a cada tubo com tecido. Triturar a mistura com uma pipeta de 10 mililitros aproximadamente 20 vezes. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico vazio de 50 mililitros.
Incubar a solução a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 15 minutos, agitando suavemente os lisados após oito minutos. Após a incubação, adicione 5 mililitros de MGM e 200 microlitros de DNase-I a cada tubo para uma concentração final de 50 microgramas por mililitro. Triturar cada lisado 10 vezes com uma pipeta de 10 mililitros.
Em seguida, deixe a suspensão celular descansar por três minutos em temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo do tubo. Transfira as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mililitros, deixando para trás o tecido não dissociado. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em 5 mililitros de MGM e triture-o 20 vezes.
Coloque as suspensões de células em frascos T-25 revestidos e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para realizar o isolamento de células precursoras de oligodendrócitos, agite as células por 15 horas. Em seguida, retirar o sobrenadante do balão e colocá-lo numa placa de Petri estéril.
Incube o sobrenadante a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos, girando após 15 minutos para remover a micróglia restante. Remova o sobrenadante celular não aderente. Conte as células e coloque-as em placas sobre uma superfície revestida de poli-D-lisina na concentração desejada.
Retorne as células à incubadora por pelo menos uma hora. Em seguida, aspire suavemente 95% do meio e adicione lentamente o meio OPC quente, pipetando-o contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs.