Isolamento e cultura de neurônios oculomotores, trocleares e motores espinhais de um embrião de camundongo

Pegue uma rata grávida transgênica e remova cirurgicamente o útero com embriões contendo neurônios motores marcados com fluorescência.

Transfira o útero para um prato com um tampão gelado sob um microscópio de fluorescência.

Use luz visível para isolar os embriões.

Remova a face e a cauda dos embriões e oriente-os para uma posição prona.

Usando o sinal de fluorescência, faça uma incisão no mesencéfalo para expor os núcleos oculomotor e troclear, que contêm neurônios motores.

Isole o mesencéfalo que contém os núcleos.

Abra o lado dorsal do rombencéfalo e da medula espinhal. Isole a medula espinhal, extirpe ambas as extremidades e colete as colunas contendo neurônios motores espinhais.

Trate os tecidos coletados com enzimas para dissociar a matriz tecidual. Colha as células individuais e isole os neurônios marcados com fluorescência usando FACS.

Adicione um meio de cultura aos neurônios isolados, transfira as células para uma microplaca revestida com substrato de cultura e incuba, permitindo que as células adiram e cresçam.

Mantenha os neurônios motores em cultura.

Comece colhendo embriões positivos para EGF Islet-1 de uma rata grávida aproximadamente 11,5 dias após a fertilização. Pulverize o abdômen completamente com etanol e remova o útero com uma tesoura de microdissecção estéril e uma pinça de curativo. Lave brevemente o útero em PBS estéril. Em seguida, transfira-o para a placa de dissecação preenchida com PBS estéril pré-resfriado.

Sob a luz forte do microscópio, remova cuidadosamente os embriões do útero usando uma tesoura de microdissecação, pinça de curativo e pinça Dumont Número 5. Em seguida, use uma colher miniperfurada Moria estéril para transferir cada embrião para um poço separado de uma placa de 24 poços preenchida com meio de baixa fluorescência Hibernate E pré-resfriado suplementado com 1X V27.

Enquanto mantém a placa no gelo, transfira um embrião para uma placa de dissecção estéril e cubra-o completamente com a solução salina balanceada de Hank ou HBSS estéril gelada. Use uma pinça para remover a face do embrião e a cauda sem danificar o mesencéfalo. Em seguida, coloque o embrião em decúbito ventral com os membros montados e a cauda apontando para a frente do microscópio.

Use uma pinça para abrir o teto do quarto ventrículo para gerar uma pequena abertura. Use esta abertura para prender uma pinça no espaço criado entre o quarto ventrículo e seu teto. Dissecar ao longo da superfície dorsal do embrião rostral ao córtex e lateral à placa do piso e à coluna motora.

Em seguida, abra o tecido dissecado em um livro aberto para revelar os núcleos CN3 e CN4 positivos para GFP. Separe cuidadosamente o mesencéfalo ventral do embrião e remova o tecido meníngeo com uma pinça e uma faca de microdissecção.

Disseque os núcleos CN3 e CN4 bilaterais positivos para GFP longe da placa de piso e de outros tecidos circundantes positivos para GFP, tomando cuidado para evitar tocar ou danificar os neurônios. Se coletar núcleos CN3 e CN4 separados, corte ao longo do mesencéfalo desses dois núcleos e use uma pipeta P1000 para coletar o tecido ventral dissecado do mesencéfalo com HBSS mínimo.

Coloque-o em um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,7 mililitro cheio de meio de dissecação. Conservar o tubo no gelo até à dissociação. Continue agrupando mesencéfalos ventrais de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda aos requisitos experimentais.

Para dissecar a medula espinhal ventral, mantenha o embrião em decúbito ventral com a cabeça voltada para a frente do microscópio. Segure-o com uma pinça e insira a ponta do outro par na parte caudal fechada do quarto ventrículo. Abra o resto do rombencéfalo e da medula espinhal dorsalmente em toda a extensão rostrocaudal do embrião. Corte o tecido dorsal começando no quarto ventrículo e trabalhando em direção ao canal central da medula espinhal caudal, usando a pinça como tesoura.

Em seguida, segure o embrião com um conjunto de pinças e retire a aba do tecido dorsal de cada lado com o outro par. Remova a medula espinhal ventral usando a faca de microdissecção para perfurar diretamente abaixo do SMN positivo para GFP, levantando a medula espinhal ventral com movimentos semelhantes a serras em ambos os lados.

Corte a medula espinhal transversalmente no limite superior do membro inferior e remova a porção lombar cervical. Corte transversalmente diretamente acima de C1, onde o primeiro corno anterior positivo para GFP se projeta. Coloque o lado dorsal da medula espinhal ventral para cima e segure-o pressionando o tecido GFP-negativo entre as colunas SMN GFP-positivas com uma pinça.

Remova o mesênquima anexado restante, DRGs e medula espinhal dorsal aparando ambos os lados da coluna SMN positiva para GFP com a faca de microdissecação. Use uma pipeta P1000 para coletar o tecido da medula espinhal ventral dissecado com HBSS mínimo e coloque-o em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro preenchido com meio de dissecação. Armazene-o no gelo até a dissociação e continue acumulando as medulas espinhais ventrais de embriões adicionais no mesmo tubo.

Adicionar o volume adequado de solução de papaína a cada um dos tubos de microcentrífuga com as amostras de tecido dissecado. Incube os tubos a 37 graus Celsius por 30 minutos, agitando os tubos a cada 10 minutos com o movimento dos dedos.

Após a incubação, triturar suavemente cada suspensão oito vezes com uma pipeta P200. Centrifugue a 300 vezes g por cinco minutos. Ressuspenda os grânulos celulares com o volume apropriado de solução inibidora de albumina ovomucóide, pipetando suavemente para cima e para baixo. Repita a centrifugação. Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta P1000. Ressuspenda as células no volume apropriado do meio de dissecação. Filtre as suspensões através de filtros de células de 70 micrômetros.

Em seguida, use a classificação FACS para isolar células GFP-positivas dissecadas de CN3, CN4 e SMN. Dilua as suspensões de células isoladas com meio de cultura de neurônios motores pré-aquecido a 37 graus Celsius para as densidades apropriadas e adicione 200 microlitros da suspensão a um poço de uma placa de 96 poços revestida com PDL-laminina. Cultive os neurônios em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, certificando-se de atualizar o meio de cultura do neurônio motor a cada cinco dias.