Diferenciando células-tronco neurais humanas em progenitores neurais e astrócitos

Comece com neuroesferas não aderentes, um agregado tridimensional de células-tronco neurais humanas em um meio condicionado derivado de cultura de células.

Este meio contém nutrientes, fatores de crescimento e componentes da matriz extracelular que mantêm a viabilidade celular.

Centrifugue para coletar as neuroesferas.

Trate-os com enzimas tripsina e DNase, misture o conteúdo e depois incube.

A tripsina interrompe a adesão célula a célula e facilita o descolamento celular, enquanto a DNase degrada o DNA livre para evitar a aglomeração celular.

Pipetar o conteúdo repetidamente para formar uma suspensão unicelular. Em seguida, adicione um inibidor de tripsina para neutralizar a atividade enzimática.

Centrifugue e remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda as células em um meio de proliferação contendo fatores de crescimento neural.

Semeie a suspensão celular em uma lamínula revestida de polímero colocada em uma placa de vários poços. Incube para permitir a fixação da célula-tronco ao polímero.

Além disso, com base na absorção de fatores de crescimento específicos, as células-tronco se diferenciam em progenitores neurais e astrócitos, que estão prontos para maturação adicional em tipos de células especializadas.

Depois de preparar o meio de cultura e plaquear as células-tronco neurais humanas de acordo com o protocolo de texto, recupere da incubadora o frasco de células a serem passadas e leve-o para o gabinete de biossegurança ou BSC. Incline suavemente o frasco, permitindo que as células afundem no fundo do meio agrupado.

Transfira 10 mililitros de meio em duas porções de 5 mililitros em um tubo limpo de 15 mililitros rotulado como "CM" para um meio condicionado. Tome cuidado para não aspirar nenhuma das células depositadas no frasco. Transfira 3 mililitros de meio do tubo CM para um tubo de 15 mililitros rotulado como "solução inibidora de tripsina". Em seguida, coloque o tubo CM de lado.

Em seguida, remova os 5 mililitros de meio e células restantes no frasco T75 e coloque-o em um tubo limpo de 15 mililitros rotulado como "células". Em seguida, lavando o balão T75 duas vezes, utilizando uma pipeta serológica e volumes de 3,5 mililitros de MC, transferindo o enxaguamento do MC para o tubo de «células». Isso removerá todas as neuroesferas do frasco T75.

Centrifugar o tubo «células» a 100 vezes g à temperatura ambiente durante cinco minutos. Enquanto as células estão girando, obtenha a solução de glicose DPBS previamente preparada do banho-maria a 37 graus Celsius e adicione a quantidade apropriada de tripsina e DNase.

Depois que o tubo de 'células' parar de girar, remova todo o sobrenadante do meio condicionado e transfira-o para o tubo CM. Adicione a solução de tripsina ao pellet de célula no tubo de 15 mililitros e use uma pipeta de 5 mililitros para pipetar para cima e para baixo aproximadamente 5 a 10 vezes. Feche a tampa do tubo e incube-o em banho-maria a 37 graus Celsius por cinco minutos.

Ao tubo inibidor de tripsina, adicione o volume apropriado de inibidor de tripsina, adicionando o mesmo volume de solução que foi usado para a solução de tripsina. Em seguida, coloque a solução inibidora de tripsina no banho-maria a 37 graus Celsius até que seja necessário.

Após a incubação, pipetar as células para cima e para baixo de 5 a 10 vezes. Em seguida, incube a amostra no banho-maria a 37 graus Celsius por mais 10 a 15 minutos. Após a incubação celular, pipetar as células para cima e para baixo até que as esferas estejam completamente dissociadas. Em seguida, adicione imediatamente a solução inibidora de tripsina e pipete a suspensão celular para cima e para baixo 10 vezes.

Para contar o número de células na suspensão, pipete 15 microlitros de pré-mistura de azul de tripano em um pequeno barco de pesagem e adicione 5 microlitros da suspensão de células. Pipete para cima e para baixo 3 a 5 vezes para misturar. Em seguida, transfira 10 microlitros da suspensão de células azuis de tripano para cada lado de um hemocitômetro, coberto com uma lamínula de vidro.

Observe as células sob um microscópio óptico e conte o número total de células em cada uma das quatro grades de canto. Em seguida, some esses números. Depois de calcular o número de células de acordo com o protocolo de texto, adicionar um volume de suspensão de células a cada balão T75 para obter 5 x 10⁶ células por balão.

Se o volume for inferior a 5 mililitros, adicione meio condicionado adicional até 5 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de novo meio DFHGFPS contendo fatores de crescimento ao balão. Certifique-se de que o frasco esteja rotulado com o tipo de células, as datas, o número de células no frasco e o número da passagem. Se desejar, incube as células neste ponto.

Para placas de HNSCs aderentes, um dia antes da passagem, limpe a BSC conforme explicado no protocolo de texto e use uma pinça para colocar lamínulas de vidro estéreis de 12 milímetros nos poços de uma placa de 24 poços. Cubra os poços com lamínulas com 250 microlitros por poço de 0,01% de Poli-D-Lisina ou PDL em água estéril e incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora. Remova o PDL dos poços e, em seguida, cubra-os com 1 micrograma por centímetro quadrado de laminina DPBS.

Incube a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Se não for necessário no dia seguinte, enrole o parafilme nas bordas da placa para selá-la e armazene-a a 4 graus Celsius. Remova qualquer excesso de solução de laminina dos poços por aspiração e use 0,5 mililitros de DPBS para enxaguar os poços uma vez. Em seguida, semeie as células em cada poço a uma densidade de 0,6 a 1 x 10⁵ células por centímetro quadrado.