Geração de organoides cerebrais do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Comece com uma placa de poço de baixa fixação contendo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou iPSCs em um meio de células-tronco suplementado com um inibidor de Rho-quinase.

Os inibidores entram nas células, bloqueiam as enzimas Rho-quinase e mantêm a viabilidade celular. Isso promove a formação de agregados iPSC.

Substitua o meio por um meio de células-tronco para permitir que os agregados cresçam. Transfira-os para uma placa de cultura de baixa fixação com um meio de indução cortical.

Os componentes desse meio fazem com que as iPSCs se diferenciem em células neuroectodérmicas, um precursor neural.

Transfira cada agregado neuroectodérmico para um filme com poços rasos.

Substitua o meio por uma matriz de membrana basal e incube para permitir a solidificação da matriz e o aprisionamento dos agregados.

Transferir estes agregados incorporados na matriz para uma placa contendo um meio de indução cortical e incubar com agitação.

Com o tempo, as células neuroectodérmicas utilizam os fatores de diferenciação e se desenvolvem em células neuroepiteliais.

Mude o meio para um meio de diferenciação organoide, que permite que as células amadureçam em tipos de células mais especializados, formando um organoide cerebral que se assemelha ao córtex do prosencéfalo.

Para gerar agregados de células-tronco pluripotentes, quando as culturas de células-tronco atingirem 70% a 90% de confluência, adicione 500 microlitros de reagente de dissociação celular a um poço da placa de cultura de seis poços para separar as células.

As células-tronco pluripotentes induzidas, que são adaptadas às condições de cultivo em monocamada, são um bom tipo de célula para gerar agregados, pois são menos propensas à morte celular induzida por estresse durante o procedimento de dissociação e agregação.

Após 5 a 10 minutos a 37 graus Celsius, bata suavemente na placa e use 2 mililitros de DMEM/F-12 para lavar as células do fundo do poço. Transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros e aumente o volume da solução celular para 10 mililitros com mais meio DMEM/F-12.

Após a contagem, transfira 4,5 vezes 10 para as terceiras células por agregado de células-tronco pluripotentes para um novo tubo de 15 mililitros e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet no volume apropriado de meio de células-tronco pluripotentes, suplementado com inibidor de ROCK 50 micromolar para atingir 4,5 x 10³ células por 150 microlitros de concentração média.

Em seguida, adicione 150 microlitros de células a poços individuais de uma placa de fundo em U de baixa fixação de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para monitorar a indução do neuroectoderma anterior, use um microscópio de cultura de tecidos para observar de perto as alterações morfológicas dos agregados de células-tronco pluripotentes todos os dias sob baixa ampliação.

No dia 1, agregados celulares com bordas claras devem ser observados. No dia 2, aspire cuidadosamente aproximadamente 2/3 do meio sem perturbar os agregados celulares no fundo de cada poço e substitua o meio descartado por 100 microlitros de meio de células-tronco pluripotentes fresco.

Entre quatro e seis dias depois, quando os agregados celulares atingirem 350 a 450 micrômetros de diâmetro e exibirem bordas lisas, use uma ponta de pipeta modificada de 100 microlitros para transferir até 20 agregados em uma única placa de cultura de baixa inserção de 6 centímetros contendo 5 mililitros de meio de indução cortical.

Substituir o meio de indução cortical por meio fresco uma vez a cada três dias, monitorando a morfologia dos agregados diariamente sob a objetiva 4x. Após quatro a cinco dias no meio de indução cortical, as bordas dos agregados celulares devem começar a clarear na superfície, indicando diferenciação neuroectodérmica, e a organização radial de um epitélio pseudoestratificado deve emergir.

Para incorporar os agregados neuroectodérmicos em um andaime de matriz, preencha um extrato de membrana basal em gelo por duas a três horas. Enquanto o extrato está descongelando, use uma tesoura estéril para cortar o filme plástico de parafina em um quadrado de 4 por 4 centímetros por 16 organoides e coloque cada pedaço de filme sobre uma bandeja vazia de ponta de micropipeta de 100 microlitros.

Pressione o filme de parafina com a ponta do dedo enluvado para que apareçam pequenas covinhas e limpe o filme com etanol a 70%. Após a irradiação UV em um gabinete de biossegurança fechado e estéril por 30 minutos, use uma ponta de pipeta modificada de 100 microlitros com uma abertura de 1 e 1/2 a 2 milímetros para transferir cada agregado celular para uma covinha no filme.

Quando todos os agregados tiverem sido transferidos, use uma ponta de pipeta de 100 microlitros não cortada para aspirar cuidadosamente o meio de cada covinha e adicione 40 microlitros de extrato de membrana basal não diluído a cada agregado celular.

Tenha cuidado para não danificar os organoides por manipulação grosseira ou aspiração na ponta da pipeta, pois isso danificará o neuroepitélio em desenvolvimento.

Use a ponta da pipeta para posicionar os agregados no meio de cada gota e use uma pinça estéril para transferir cuidadosamente a folha de filme plástico de parafina para uma placa de Petri de 10 centímetros. Coloque o prato na incubadora por 15 a 20 minutos.

Enquanto o extrato está solidificando, adicione 5 mililitros de meio de indução cortical fresco a uma placa de cultura de baixa fixação de seis centímetros. No final da incubação, vire a folha de filme de parafina e use uma pinça estéril para espremer suavemente até 16 gotículas polimerizadas em cada prato de 6 centímetros. Em seguida, devolva os agregados à incubadora de cultura de células.

No dia seguinte, transfira as placas de cultura organoide para um agitador de cultura de células oscilante inclinado em um ângulo de 5 graus a 14 RPM dentro de uma incubadora de cultura de células com monitoramento diário de microscopia de luz até que os agregados atinjam o estágio de diferenciação de interesse.