Formação e expansão de neuroesferas a partir de um tecido hipocampal

Comece com um giro dentado hipocampal de camundongo pós-natal, um tecido cerebral rico em células-tronco neurais e progenitoras com capacidade de auto-renovação.

Adicione enzimas tripsina que dissociam a matriz extracelular do tecido, soltando as células.

Em seguida, remova as enzimas e lave o tecido repetidamente com um tampão.

Substitua o tampão por um meio de cultura de neurônios enriquecido com fatores de crescimento.

Pipete repetidamente para dissociar o tecido e liberar as células no meio.

Semear a suspensão de células diluídas numa placa de Petri não revestida e incubar.

As células-tronco e progenitoras utilizam nutrientes e fatores de crescimento para proliferar.

Com o tempo, eles se agregam espontaneamente, formando estruturas tridimensionais flutuantes denominadas neuroesferas primárias com uma população de células heterogênea.

Colete essas neuroesferas e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as neuroesferas em um meio de cultura de neurônios e dissocie em uma suspensão unicelular.

Recultive essas células em uma placa de Petri não revestida para formar neuroesferas secundárias com uma população de células relativamente homogênea.

Para dissociar as amostras SVZ e DG, adicione tripsina-EDTA 0,05% a uma concentração final de 5% a 10% de tripsina-EDTA em HBSS para cada tubo por uma incubação de aproximadamente 15 minutos a 37 graus Celsius.

O uso excessivo de tripsina ou um tempo de incubação muito longo pode levar ao aumento da morte celular, impactando negativamente o crescimento celular.

E o tecido se aglomerou, substitua a solução enzimática por quatro lavagens consecutivas por 1 mililitro de HBSS fresco e suplementado por lavagem. Após a última lavagem, ressuspenda os tecidos digeridos em 1 mililitro de meio isento de soro, suplementado com 10 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico e 5 nanogramas por mililitro de fator de crescimento básico de fibroblastos por tubo.

Em seguida, dissocie mecanicamente os tecidos com uma pipetagem suave 7 a 10 vezes com uma pipeta P1000, até obter uma solução celular homogênea. Para determinar a densidade do DG dissociado na célula SVZ, conte as células em cada suspensão em um hemocitômetro.

Para expandir as células em neuroesferas, dilua as populações de células individuais em uma densidade de 2 x 10⁴ células por mililitro, em meio livre de soro, suplementado com fatores de crescimento, e semeie 5 mililitros da suspensão celular em placas de Petri de 60 milímetros de diâmetro não revestidas. Em seguida, incube as células SVZ por seis a oito dias e as células DG por 10 a 12 dias a 37 graus Celsius para a formação da neuroesfera primária.

Quando a maioria das neuroesferas tiver um diâmetro de 150 a 200 micrômetros, colha a suspensão celular das culturas e colete as neuroesferas por centrifugação. Ressuspenda o pellet da neuroesfera com um kit de dissociação química de camundongo de acordo com as instruções do fabricante.

Antes de coletar as células com outra centrifugação, substitua o sobrenadante por 1 mililitro de meio sem soro suplementado com fatores de crescimento e triture suavemente o pellet cerca de 10 vezes.

Conte as células neurais dissociadas conforme demonstrado e replante as células com uma densidade de 2 x 10⁴ células por mililitro, em meio sem soro suplementado com fatores de crescimento em novas placas de Petri de 60 milímetros. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura de células por mais 6 a 8 ou 10 a 12 dias, conforme apropriado, para obter neuroesferas secundárias.