Co-cultura de células de Schwann com neurônios DRG em uma membrana pré-esticada

Pegue uma câmara de silício conectada a uma membrana de silício esticada e revestida com matriz.

Adicione gânglios da raiz dorsal ou suspensão de células DRG e incuba.

A matriz promove a fixação e multiplicação celular, enquanto a superfície esticada orienta o alinhamento do axônio.

Adicione inibidores de crescimento que eliminam as células gliais em divisão ativa, permitindo que os neurônios que não se dividem sobrevivam.

Remova o meio. Adicione um meio de crescimento e incube.

O neurônio detecta um aumento da rigidez da membrana na direção esticada e orienta o crescimento do axônio de acordo.

Adicione células de Schwann cultivadas e colhidas à cultura DRG e incuba.

As células de Schwann se ligam ao axônio regenerado, isolando o neurônio.

Isso aumenta a sobrevivência e a funcionalidade dos neurônios, estabelecendo uma co-cultura.

Antes de semear os neurônios DRG, remova a solução de PLL da câmara. Enxágue a superfície do PDMS com água estéril e seque-a ao ar. Depois de ressuspender as células, deixe a suspensão descansar por 1 a 2 minutos para permitir que os detritos se depositem no fundo do tubo. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de suspensão celular em cada câmara de estiramento e incube-a a 37 graus Celsius com 5% de CO₂.

Para eliminar as células gliais em um dia in vitro, adicione 10 microlitros ou 15 microlitros da solução estoque da mistura FdU / U a cada poço. Após 7 horas, substitua este meio por meio de crescimento padrão fresco e coloque o dispositivo de cultura pré-estirado em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de CO₂. Durante o período de cultura celular, troque o meio a cada dois dias, substituindo metade do meio gasto por meio novo.

Neste procedimento, remova o meio de cultura das células de Schwann e adicione 5 mililitros de tripsina-EDTA a 0,05% no frasco. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de CO₂ por 2 a 3 minutos. Verifique as células sob o microscópio óptico usando uma objetiva de 10x para ver se elas se levantam do frasco. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio de cultura às células do frasco e misture.

Em seguida, adicione a suspensão celular a um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a 20 graus Celsius por 5 minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 7 mililitros de meio de crescimento DOG padrão. Em seguida, transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro. Misture com 10 microlitros de azul de tripano e, em seguida, conte o número de células com um hemocitômetro, usando uma objetiva de 10x.

Adicione o meio de crescimento para diluir a suspensão celular para 5.000 células por mililitro. Em seguida, remova 0,5 mililitros do meio da cultura DRG na câmara esticada e adicione 0,5 mililitros de suspensão de células de Schwann à cultura DRG. Cultive as células por uma semana a 37 graus Celsius em 5% de CO₂. Troque o meio a cada dois dias, substituindo metade do meio gasto por meio de crescimento padrão fresco.