Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:52 min • July 8th, 2025
Pegue tecidos adiposos periaórticos transgênicos colhidos de camundongos contendo células-tronco derivadas de tecido adiposo que expressam proteínas fluorescentes descendentes de células da crista neural, ou NCCs.
Adicione o meio de digestão e pique os tecidos.
Transfira o tecido picado com o meio de digestão para um tubo. Dissocie mecanicamente os fragmentos.
incubar. A colagenase no meio digere a matriz extracelular do tecido, liberando células-tronco, adipócitos e fibroblastos.
Adicione meios contendo soro para interromper a atividade da colagenase. Centrifugue e descarte o sobrenadante contendo adipócitos.
Ressuspenda as células na mídia e filtre para remover agregados.
Centrifugar o filtrado e remover o sobrenadante. Ressuspenda as células no tampão de lise eritrocitária para lisar os eritrócitos.
Adicione tampão contendo soro para interromper a lise. Centrifugue e descarte o sobrenadante.
Ressuspenda as células no buffer.
Execute a classificação de células ativadas por fluorescência para isolar células-tronco fluorescentes.
As células-tronco isoladas podem ser usadas para experimentos futuros.
Transfira o tecido adiposo colhido para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mililitros, contendo 1 mililitro de meio de digestão recém-preparado, e use uma tesoura cirúrgica para picar os tecidos. Transfira a pasta de tecido para um tubo de 50 mililitros contendo 9 mililitros de meio de digestão fresco e use uma pipeta de 1 mililitro para triturar os tecidos 10 vezes.
Quando uma solução homogênea for obtida, incube o tubo por 30 a 45 minutos a 37 graus Celsius e 100 rotações por minuto, verificando a cada 5 a 10 minutos para evitar a digestão excessiva. Quando uma solução de tecido adiposo homogêneo amarelo claro puder ser observada após um giro suave do tubo, interrompa a digestão com 5 mililitros de HDMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Após uma mistura completa, centrifugue a amostra de tecido adiposo.
A fração de células vasculares estromais será visível como uma pelota acastanhada. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de cultura e filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrômetros.
Colete as células por outra centrifugação e ressuspenda suavemente o pellet em 5 mililitros de tampão de lise eritrocitária. Transfira a suspensão para um tubo de 15 milímetros. Após 10 minutos, interrompa a reação com duas centrifugações em 10 mililitros de PBS, suplementado com soro bovino fetal a 1%.
Após a segunda centrifugação, ressuspender o pellet em 5 mililitros de meio de cultura em gelo e recolher as células com centrifugação final. Em seguida, ressuspenda as células em 5 mililitros de tampão FACS para contagem.
Para configurar uma cultura NCADSC após seu isolamento por FACS de acordo com os protocolos padrão, coloque as células em uma concentração de 5 x 103 células por cm2 em cada poço, uma placa de cultura de 12 poços em meio de cultura completo, a 37 graus Celsius, e 5% de dióxido de carbono por 20 a 24 horas. No dia seguinte, lave as células com PBS 37 Celsius e alimente a cultura com meio de cultura fresco.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para o isolamento, cultivo e indução da diferenciação adipogênica em células-tronco derivadas de tecido adiposo derivadas da crista neural (NCADSCs) do tecido adiposo periaórtico murino. O método utiliza camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em células da crista neural, permitindo a identificação precisa e a separação das NCADSCs para aplicações posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de células-tronco
- Isolamento e cultivo celular
- Pesquisa em tecido adiposo
Antecedentes
- As células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) são um recurso valioso para a medicina regenerativa.
- As ADSCs derivadas da crista neural possuem propriedades e origens desenvolvimentais únicas.
- O isolamento de populações puras de NCADSCs requer técnicas específicas de marcação e separação.
- O tecido adiposo peri-aórtico murino serve como fonte para essas células-tronco.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um protocolo reprodutível para o isolamento de NCADSCs marcados com fluorescência a partir do tecido adiposo periaórtico de camundongo.
- Permitir o cultivo e expansão eficientes de NCADSCs classificados.
- Facilitar aplicações posteriores, incluindo indução adipogênica e estudos funcionais.
Métodos Utilizados
- Coleta de tecido adiposo periaórtico de camundongos transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em células da crista neural.
- Mineração mecânica e digestão enzimática (colagenase) do tecido adiposo para liberar células do estroma vascular.
- Filtração e lise de eritrócitos para purificar a suspensão celular.
- Classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar NCADSCs fluorescentes.
- Cultivo de NCADSCs classificadas em meio completo sob condições padrão.
Resultados Principais
- Isolamento eficiente de NCADSCs marcados com fluorescência a partir do tecido adiposo periaórtico murino.
- Remoção de adipócitos e eritrócitos fornece uma fração purificada de células estromais vasculares.
- A citometria de fluxo permite a seleção de células-tronco derivadas da crista neural para cultivo.
- Os NCADSCs isolados podem ser expandidos in vitro para uso experimental posterior.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para o isolamento e cultivo de NCADSCs a partir do tecido adiposo de camundongo.
- A marcação fluorescente e a FACS garantem alta pureza de células-tronco derivadas da crista neural.
- A técnica permite aplicações posteriores na biologia de células-tronco e na pesquisa de tecido adiposo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de células-tronco derivadas de adipócitos derivadas da crista neural (NCADSCs) a partir do tecido adiposo peri-aórtico murino permite a validação de alvos em modelos de doenças metabólicas e vasculares. A marcação fluorescente e a purificação por FACS fornecem um sistema reproduzível para a redução de riscos mecanicista de terapias com células-tronco. Esta abordagem reforça a confiança preditiva na triagem pré-clínica, garantindo a homogeneidade celular e a rastreabilidade de linhagem.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as contribuições de células-tronco derivadas da crista neural na homeostase e na patologia do tecido adiposo.
- Valor Operacional: Fornece uma população celular purificada e marcada com fluorescência para leituras experimentais consistentes.
- Valor Preditivo: Apoia a confiança no alvo ao isolar uma fração estromal vascular definida para ensaios funcionais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera uma fonte padronizada e viável de células para diferenciação adipogênica e triagem de resposta a fármacos.
- Valor Operacional: Garante a reprodutibilidade do ensaio mediante a eliminação de contaminantes fibroblásticos e adipócitos por meio de FACS.
- Escalabilidade: Permite a expansão de linhagens clonais de NCADSC para testes de compostos em alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta o comportamento de células-tronco in vitro à relevância do nicho adiposo periaórtico in vivo.
- Redução de Riscos Mecanística: Permite a avaliação do potencial adipogênico e da diferenciação fora do alvo em um modelo com rastreamento de linhagem.
- Modelo Pré-clínico: Permite testes relevantes à doença de reguladores metabólicos em um contexto de interface vascular-adiposo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O fluxo de trabalho de isolamento se insere na transição entre as fases iniciais de descoberta e pré-clínica, fornecendo uma entrada celular definida para validações funcionais subsequentes e esforços de identificação de compostos promissores.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre o papel das células-tronco da crista neural na fibrose e inflamação do tecido adiposo.
- Triagem: Fornece uma população celular purificada e aderente, pronta para exposição a compostos e leitura de fenótipos.
- Análises: Permite a avaliação quantitativa da eficiência de diferenciação e das taxas de proliferação após o isolamento.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o comportamento celular à comunicação cruzada entre vasos sanguíneos e tecido adiposo em modelos de aterosclerose e obesidade.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma linhagem celular-tronco bancável e geneticamente rastreável para reutilização em múltiplos projetos dentro de programas de doenças metabólicas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar um subconjunto de células-tronco geneticamente definido a partir de tecido adiposo heterogêneo.
- Valor Operacional: Padroniza o material inicial por meio de purificação baseada em FACS, melhorando a consistência entre experimentos.
- Valor Estratégico: Aumenta a confiabilidade das decisões de prosseguimento ou interrupção ao minimizar a variabilidade nas entradas de células vasculares estromais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos moduladores de células-tronco com base em respostas específicas à linhagem.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos murinos, digestão enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência.
- Depende do acesso à colagenase, instrumentação de FACS e infraestrutura estéril para cultivo celular.
- Necessita padronização do tempo de digestão e dos tampões de lise para garantir um rendimento consistente da fração vascular estromal.
- A adaptação a outros depósitos adiposos pode exigir otimização dos parâmetros de dissociação.
- Limitado pela especificidade da expressão do transgene; a fluorescência de fundo pode exigir controles de seleção por portas.
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Última atualização: 29 agosto 2026