Isolando células gliais entéricas da submucosa e lâmina própria de um camundongo

Pegue um segmento do intestino delgado de camundongo previamente despojado do músculo longitudinal e do plexo mioentérico, camadas contendo neurônios entéricos e células gliais.

Corte o tecido e coloque-o em um tampão contendo EDTA. Incubar com balanço.

O EDTA interrompe as junções célula-célula, descolando a mucosa epitelial da lâmina própria subjacente e da submucosa, camadas de tecido conjuntivo contendo células gliais entéricas.

Pipete repetidamente para desalojar as células epiteliais.

Filtre através de um filtro de célula e descarte o fluxo.

Transfira o tecido para um tampão de dissociação não enzimático e incube-o com balanço. O tampão de dissociação solta a lâmina própria e a matriz extracelular submucosa, desprendendo as células.

Pipete repetidamente para dissociar ainda mais as células.

Filtre através de um filtro de células para coletar as células.

Centrifugue e ressuspenda as células em um tampão.

Pegue poços revestidos de proteínas de adesão contendo um meio de crescimento glial e coloque as células em placas.

O revestimento facilita a adesão celular, enquanto os fatores de crescimento promovem seletivamente a proliferação de células gliais, estabelecendo uma lâmina própria e uma cultura de células gliais submucosas.

Para remover a mucosa epitelial, primeiro use uma tesoura fina para cortar os intestinos em pedaços de aproximadamente 0,5 centímetro e colete os pedaços em 30 mililitros de solução gelada de EDTA / HEPES / DPBS. Agite a solução contendo tecido a 4 graus Celsius por 10 minutos a aproximadamente 60 inclinações por minuto.

Umedeça previamente uma pipeta de plástico de 5 mililitros pipetando o tampão EDTA / HEPES / DPBS para cima e para baixo uma vez e, em seguida, use a pipeta pré-umedecida para triturar o tecido e a suspensão tampão 20 vezes para desalojar a mucosa epitelial.

Colete o tecido despejando a mistura através de um filtro de células de náilon de 100 mícrons e use uma pinça de nariz agulhado para colocar o tecido retido no filtro em um novo tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de EDTA / HEPES / DPBS gelado. Repita a incubação EDTA / HEPES / DPBS uma segunda vez, balançando o tecido a 4 graus Celsius por 10 minutos a aproximadamente 60 inclinações por minuto para remover a mucosa epitelial adicional.

Faça uma trituração suave usando uma pipeta pré-umedecida de 5 mililitros. O tecido tenderá a grudar no interior da pipeta à medida que mais do epitélio é removido.

É necessária uma trituração suave neste momento, uma vez que as células gliais entéricas são mais frágeis.

Colete o tecido após a segunda incubação, despejando a mistura através de um filtro de células de náilon de 100 mícrons e descarte o fluxo. O segundo fluxo deve ser visivelmente menos turvo do que o primeiro. Repita as incubações de EDTA de 10 minutos até que a solução esteja quase límpida.

Transfira o tecido do filtro de náilon para um tubo centrífugo cônico de 15 mililitros contendo 5 mililitros da solução de recuperação celular disponível comercialmente. Em seguida, balance por 25 a 30 minutos a 4 graus Celsius. Triturar suavemente 10 vezes para dissociar as células gliais entéricas da lâmina própria, depois filtrar através de um filtro de 40 mícrons e coletar o filtrado em um tubo limpo de 50 mililitros.

Enxágue o lenço do filtro de náilon com 1 mililitro de DPBS. Descarte o tecido e transfira os 5 a 6 mililitros de filtrado para um tubo de centrífuga cônico limpo de 15 mililitros. Gire o filtrado a 2.000 vezes g em uma centrífuga de balde oscilante por cinco minutos a 4 graus Celsius.

Ressuspenda o pellet contendo células gliais em pelo menos 1 mililitro de tampão de ressuspensão, pipetando suavemente o pellet para cima e para baixo com a ponta da pipeta de 500 microlitros sem introduzir bolhas. Finalmente, coloque as células gliais entéricas adicionando 200 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de 6 poços revestida com laminina ou 100 microlitros a cada poço de uma placa de 12 poços contendo meios de crescimento glial.