Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

Comece com uma argamassa de vidro frio contendo tecido cerebral cortical de rato, que é a camada mais externa do cérebro.

Adicione um tampão de microvasos cerebrais ou BMB, contendo inibidores de protease.

Agora, mova o pilão para cima e para baixo para dissociar o tecido.

Essa agitação libera as unidades neurovasculares, ou NVUs, compreendendo microvasos, pericitos, neurônios e células gliais. Os inibidores de protease bloqueiam as proteases liberadas, protegendo os microvasos.

Transfira esta mistura para um tubo.

Adicione uma solução densa de polissacarídeo. Use um vórtice para misturar a solução com outros conteúdos uniformemente.

centrifuga. Os polissacarídeos densos permitem a sedimentação de NVUs, que são mais densas que os detritos teciduais.

Descarte o sobrenadante e ressuspenda as NVUs em BMB contendo inibidor de protease e solução de polissacarídeo.

Use o vórtice para misturar o conteúdo.

Repita o processo de centrifugação. Descarte o sobrenadante para remover quaisquer detritos residuais.

Ressuspenda as NVUs no BMB e armazene-as para análise posterior.

Coloque o tecido cerebral cortical em uma argamassa de vidro gelada. Em seguida, adicione 5 mililitros de BMB com coquetel inibidor de protease. Usando um homogeneizador de potência suspenso, insira um pilão no almofariz e homogeneize o tecido cerebral usando 15 movimentos para cima e para baixo a 3.700 RPM. Em seguida, despeje o homogeneizado em tubos de centrífuga rotulados. Entre as amostras, use etanol a 70% para limpar o pilão.

Para realizar a centrifugação, adicione 8,0 mililitros de solução de dextrana a 26% a cada tubo de centrífuga rotulado contendo homogeneizado cerebral. Inverta o tubo duas vezes e, em seguida, vortex completamente a amostra. Conduza o vórtice de cada amostra usando vários ângulos para garantir uma mistura completa da solução homogeneizada do cérebro com a solução de dextrano a 26%. Centrifugue as amostras a 5.000 g e 4 graus Celsius por 15 minutos.

Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5,0 mililitros de BMB com coquetel de inibidores de protease. Em seguida, vortex o pellet para garantir uma mistura completa. Em seguida, adicione 8,0 mililitros de dextrano a 26% a cada tubo de centrífuga e vórtice, conforme demonstrado. Em seguida, centrifugue novamente as amostras.

Usando um balão de vácuo e uma pipeta de vidro, aspire o sobrenadante e certifique-se de que o pellet contendo o microvaso cerebral não seja rompido. Ressuspenda o pellet em BMB com inibidor de protease e, em seguida, 26% de dextrano mais duas vezes. Após a centrifugação final, adicione 5,0 mililitros de BMB a cada pellet e vórtice para ressuspender a amostra.