Preparação de fatias colículo-talamocorticais de um cérebro de filhote de camundongo

Coloque o cérebro de um filhote de rato em uma lâmina com o lado dorsal voltado para cima.

Apare a frente do cérebro e reposicione-a na superfície plana criada.

Alinhe a superfície dorsal e a linha média do cérebro na lâmina. Corte em um ângulo para alinhar as estruturas auditivas conectadas do mesencéfalo e do prosencéfalo. Essas estruturas são o colículo inferior ou IC, corpo geniculado medial ou MGB, núcleo reticular talâmico ou TRN e córtex auditivo ou AC.

Prenda a superfície cerebral cortada angularmente em um estágio de amostra de vibratomo com blocos de ágar, garantindo que o rombencéfalo esteja apoiado no bloco mais fino.

Transfira o stage para o vibratomo e adicione um buffer para evitar danos aos tecidos.

Comece a fatiar para localizar o IC, MGB, TRN e AC.

Recupere a fatia contendo as regiões conectadas, denominada fatia colículo-tálamo-cortical, e transfira a fatia para uma câmara de retenção para preservar a viabilidade do tecido.

Para preparar a etapa de corte para fatiar, corte um pequeno pedaço de ágar 3% de aproximadamente 1 centímetro cúbico para ser usado como um batente para o cérebro, e outro pedaço de 1,5 centímetro por 1,5 milímetro por 3 milímetros para ser usado como uma protuberância para apoiar o colículo inferior.

Em seguida, cole o batente no palco com adesivo de cianoacrilato e, em seguida, cole a saliência no lado direito do batente de forma que formem um ângulo de 80 graus. Em um slide marcado com duas linhas a 90 graus e uma linha diagonal a 17 graus do canto superior esquerdo para o canto inferior direito, coloque o lado dorsal do cérebro para cima no ponto de interseção das duas linhas.

Usando uma lâmina de barbear, remova 2 a 4 milímetros da extremidade rostral do cérebro para criar uma superfície plana. Em seguida, coloque o lado caudal do cérebro para cima na superfície plana recém-criada. Alinhe a superfície dorsal do cérebro com uma linha horizontal e a linha média do cérebro com uma linha vertical marcada no slide. Em seguida, alinhe a lâmina de barbear com uma linha de 17 graus. Incline a navalha em um ângulo de 30 graus e remova aproximadamente 3 milímetros do córtex direito em um corte diagonal duplo.

Para montar o cérebro no estágio de vibrato, coloque um pequeno pedaço de papel de filtro no lado ventral do cérebro para que a dimensão longa fique perpendicular à linha média. Aplique cuidadosamente uma pequena quantidade de adesivo de cianoacrilato na área em frente ao batente traseiro e à esquerda da saliência. Em seguida, coloque o lado do cérebro cortado diagonalmente na cola de modo que a parte caudal do cérebro e o rombencéfalo fiquem apoiados na protuberância e o lado direito do cérebro fique contra o recuo.

Neste procedimento, coloque rapidamente o estágio de corte no vibratome. Encha o palco com solução de corte. Em seguida, alinhe a lâmina com a parte superior do cérebro. Remova 1 a 1,5 milímetros do topo do cérebro. Em seguida, corte e remova mais fatias de 300 a 500 micrômetros enquanto se aprofunda.

Quando o colículo inferior, o corpo geniculado medial e o núcleo geniculado lateral são visíveis, o giro dentado deve aparecer em forma de C e a estrutura deve estar alinhada. Obtenha cerca de duas fatias de 600 micrômetros. Estas são as fatias coliculotálamo-corticais. Depois disso, transfira-os para a câmara de retenção de 32 graus Celsius.