Uma técnica para colher e dissociar gânglios da raiz dorsal para culturas neuronais

Pegue uma seção da coluna vertebral de um rato e divida-a para remover a medula espinhal.

Separe os gânglios da raiz dorsal, ou DRGs, um aglomerado de neurônios cercado por células gliais satélites, ou SGCs.

Coloque os DRGs em um meio de crescimento. Remova as raízes nervosas para reduzir a contaminação por SGC.

Trate com colagenase para degradar a matriz tecidual e lave para remover as enzimas.

Introduza tripsina para interromper as conexões intercelulares. Adicione um soro contendo proteínas que desativam a tripsina.

Adicione o meio de crescimento e dissocie mecanicamente o tecido. Filtrar a suspensão para isolar as células individuais e centrifugar para remover os restos do tecido.

Ressuspenda as células para colocá-las em camadas em um meio de gradiente de densidade e centrifugue.

Os neurônios com maior densidade se instalam na parte inferior, facilitando a separação dos SGCs.

Ressuspenda os neurônios em um meio de cultura. Transfira-os para um poço revestido com substrato de cultura, permitindo a fixação das células.

Suplemento com fatores de crescimento nervoso para sobrevivência neuronal.

Para obter os neurônios DRG após a coleta da medula espinhal, comece removendo todas as partes dorsais e, em seguida, use uma tesoura cirúrgica estéril e afiada para dividir a coluna vertebral ao meio ao longo do eixo longitudinal, expondo o tecido do cordão. Corte a coluna vertebral em dois segmentos menores abaixo do nível da caixa torácica e, em seguida, use uma pinça fina para remover suavemente todo o tecido do cordão, tomando cuidado para não puxar e remover as raízes DRG, que aparecem como filamentos brancos saindo diretamente dos canais.

Depois que todo o tecido central for removido, use uma pinça muito fina para puxar toda a raiz do DRG, alcançando profundamente os canais vertebrais e tomando cuidado para não danificar as raízes dos gânglios. Coloque o DRG em uma placa de Petri de 60 milímetros quadrados contendo 3 a 4 mililitros de meio F-12 de Ham, suplementado com antibióticos. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use uma pinça estéril e um bisturi para limpar qualquer excesso de raízes nervosas ao redor dos gânglios para reduzir a contaminação das células satélites.

Em seguida, transfira o DRG para uma placa de Petri de 35 milímetros quadrados contendo 1,8 mililitros de meio F-12 fresco e adicione 200 microlitros de solução estoque de colagenase tipo 4. Incubar o DRG durante uma hora e, em seguida, aspirar cuidadosamente o meio com uma pipeta de vidro, tendo o cuidado de não aspirar ou danificar o DRG.

Repita a etapa da colagenase e lave o DRG com meio F-12. Após a segunda lavagem, adicione 1,8 mililitros de meio F12 e 200 microlitros de tripsina às células, removendo a tripsina e adicionando 1 mililitro de meio suplementado com 500 microlitros de FBS para interromper a reação enzimática. Em seguida, aspire o meio e lave suavemente o DRG com meio F-12 três vezes para remover todos os vestígios do soro.

Agora, alimente as células com 2 mililitros de meio F-12 fresco e use uma pipeta de vidro para transferir cuidadosamente a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Pipete para cima e para baixo 8 a 10 vezes para dissociar suavemente os neurônios e, em seguida, permita que o pellet se acumule no fundo do tubo. Quando o pellet estiver assentado, transfira o sobrenadante para um novo tubo e adicione 2 mililitros de meio F12 fresco ao pellet, repetindo a dissociação mecânica e a transferência do meio até que a suspensão se torne homogênea.

Em seguida, triturar a suspensão celular três a quatro vezes, seguida de filtração da suspensão homogeneizada resultante através de um filtro de células de 100 mícrons em um novo tubo de 50 mililitros. Centrifugue as células em um tubo de 15 mililitros. Enquanto eles estão girando, pipete lentamente albumina de soro bovino a 15% recém-preparada pelo interior de um tubo de 15 mililitros mantido em um ângulo de 45 graus para criar uma trilha gradual de proteína usando os números no tubo como referência para a trilha de formação.

Em seguida, aspire o sobrenadante das células, guardando os últimos 500 microlitros para ressuspender o pellet, e distribua lentamente as células ao longo da trilha de proteína para o novo tubo. Depois de girar as células novamente, ressuspenda o pellet em 1 mililitro de meio BS modificado e semeie as células em um pequeno volume de meio em uma placa de 24 poços por duas horas. Quando as células estiverem ligadas, adicione meio BS fresco suplementado com 50 nanogramas por mililitro de fator de crescimento nervoso.