Uma técnica para otimizar a cultura de organoides cerebrais usando iluminação lateral de luz suave

Pegue uma configuração de iluminação de luz suave lateral contendo uma placa de acrílico equipada com almofadas brancas e luzes LED brancas instaladas em uma borda.

Posicione uma placa de vários poços de baixa adesão contendo meio de formação de corpo embrióide na frente.

Adicione os corpos embrióides, ou EBs, ao prato.

A luz LED entra pela lateral da placa de acrílico e emite feixes paralelos, iluminando lateralmente os EBs e permitindo a visualização a olho nu.

Gire a placa para induzir um fluxo de redemoinho, convergindo os EBs para o centro.

Substitua o meio gasto por meio de formação EB fresco.

Colete os EBs usando uma ponta de pipeta de diâmetro largo.

Segure a pipeta na vertical para permitir que os EBs assentem por gravidade.

Transfira os EBs para outra placa de baixa adesão contendo um meio de indução neural.

Toque a ponta no meio. Os EBs afundam devido à tensão superficial do líquido.

Fatores específicos no meio iniciam a diferenciação neural nos EBs, formando uma camada neuroepitelial.

Use uma placa de acrílico transparente com espessura de 0,3 a 0,5 centímetros no tamanho de papel A5 e cole almofadas brancas na frente e atrás da placa de acrílico. Em seguida, instale uma fileira de luzes brancas LED na borda da placa para que as luzes possam entrar pela lateral da placa de acrílico e depois disparar em paralelo.

Agora, prepare uma nova placa de baixa adesão de seis poços e adicione 2 mililitros de meio de formação EB a cada poço. Depois de remover os EBs junto com o meio, usando a ponta da pipeta de 1000 microlitros de diâmetro largo, transfira aproximadamente 100 EBs por poço para a placa de baixa adesão de 6 poços.

Para substituir o meio de formação EB todos os dias pelo mesmo volume de meio fresco, induza um fluxo de redemoinho girando o prato ao longo de uma órbita circular. Os EBs ou organoides convergem para o centro do poço devido ao fluxo secundário gerado pela rotação. Aspire o meio antigo pipetando lentamente até a borda do poço. Não chupe com muita força, caso contrário, os EBs serão removidos juntos. Em seguida, adicione novas mídias para ressuspender os EBs.

Para indução neural, prepare uma nova placa de baixa adesão de 6 poços com 3 mililitros de meio de indução neural por poço. Ligue a luz suave lateral e desligue outras fontes de luz internas. Agora, transfira os EBs para a placa de 6 poços com meio de indução neural adicionado usando uma ponta de pipeta de boca larga para sugar os EBs e o meio de cultura. Em seguida, segure a pipeta na vertical. Os EBs afundarão gradualmente sob a gravidade e convergirão para a boca da ponta da pipeta.

À medida que a boca da ponta da pipeta toca a superfície do líquido novamente, e devido à tensão superficial do líquido, os EBs afundam rapidamente no meio. Incube as amostras a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.