Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:45 min. • July 8th, 2025
Pegue uma raiz nervosa e corte-a em pedaços pequenos.
Transfira para um tubo contendo enzimas digestivas e incuba.
A enzima digere a matriz extracelular.
Adicione meios contendo soro para interromper a digestão.
Pipetar o conteúdo repetidamente, centrifugar e eliminar o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet.
Passe a suspensão por uma peneira para remover o tecido não digerido. Incube as células coletadas em uma placa.
Fibroblastos e células de Schwann ou SCs se ligam à placa e se dividem.
Remova as células soltas. Lave as células anexadas com um tampão fosfato.
Adicione enzimas digestivas para soltar os SCs sensíveis à digestão. Pare a digestão com meios.
Separe completamente os SCs adicionando mídia.
Transfira as células para um tubo e centrifugue. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em meios específicos para SC.
Transfira as células para uma placa não revestida e incuba.
Quaisquer fibroblastos restantes irão aderir, deixando os SCs em suspensão.
Transfira a suspensão para uma placa revestida com matriz.
Incubar para fixação e divisão de células de Schwann.
Corte os nervos em pedaços de 3 a 5 milímetros com uma tesoura. Adicione 1 mililitro de tripsina a 0,25% e transfira os pedaços nervosos para tubos de centrífuga de 5 mililitros. Incube a 37 graus Celsius por 18 a 20 minutos. Em seguida, para interromper a digestão, adicione 3 a 4 mililitros de DMEM contendo 10% de soro bovino fetal. Pipete a mistura para cima e para baixo suavemente, cerca de 10 vezes. Centrifugue a 800 vezes g por 5 minutos.
Após a centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 2 a 3 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS. Filtre a suspensão celular através de um filtro de malha 400 e, em seguida, use a suspensão para inocular uma placa de Petri de 60 milímetros. Incube as placas de Petri por 4 a 5 dias a 37 graus Celsius na presença de 5% de dióxido de carbono.
Quando a cultura atingir 90% de confluência, lave as células uma vez usando 1X PBS. Em seguida, para digerir as células de Schwann, adicione 1 mililitro de tripsina a 0,25% a 37 graus Celsius por prato de 60 milímetros. Após 8 a 10 segundos em temperatura ambiente, pare a digestão adicionando 3 mililitros de DMEM suplementado com 10% de FBS. Para separar as células de Schwann, sopre suavemente nas células com uma pipeta.
Verificar ao microscópio se as células estão separadas. Em seguida, colete o meio, que contém as células de Schwann, e centrifugue a 800 x g por 5 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 3 mililitros de meio. Use a suspensão para inocular placas de Petri de 60 milímetros não codificadas e incube as placas a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Transfira o meio, que conterá as células de Schwann, para uma placa de meio revestida de poli-L-lisina e incube a placa a 37 graus Celsius por 2 dias.