Preparando tubos endoteliais cerebrais a partir de arteríolas parenquimatosas de camundongos

Prenda um cérebro de camundongo, com o lado ventral para cima, em uma placa revestida de polímero de silício contendo tampão.

Disseque uma seção de tecido do hemisfério ao redor da artéria cerebral média, ou MCA, com o segmento de tecido superior estendendo-se além do ponto de ramificação do Círculo de Willis.

Prenda o tecido com o MCA voltado para cima.

Remova a pia-máter, com as arteríolas, que se ramificam da ACM.

Prenda a pia-máter com as arteríolas. Disseque a arteríola e remova o tecido circundante. Descarte todos os ramos distais.

Incube a arteríola em um coquetel de enzimas proteolíticas para facilitar a digestão parcial do segmento.

Substituir as enzimas por tampão e transferir o segmento digerido para uma câmara contendo tampão numa fase microscópica equipada com uma pipeta de trituração.

Pipete a arteríola repetidamente para remover a adventícia solta e as células musculares lisas, resultando em um tubo intacto contendo células endoteliais arteriolares.

Coloque o lado ventral do cérebro voltado para cima em uma câmara contendo solução de dissecção fria para isolar as arteríolas parenquimatosas. Para isolar as artérias parenquimatosas, prenda o cérebro isolado com pinos de aço e solução de dissecção a frio em uma placa de Petri contendo revestimento de polímero de silicone com infusão de carvão com mais de 50 centímetros de profundidade.

Corte um retângulo de tecido cerebral de ambos os hemisférios com uma tesoura de dissecção afiada e alinhada ao redor da MCA, garantindo que a parte superior do segmento de tecido passe do ponto de ramificação do círculo de Willis. Prenda o tecido cerebral no prato com o MCA voltado para cima com pinos de aço. Faça cuidadosamente uma incisão rasa perto dos pinos e remova a pia com uma pequena pinça, descascando suavemente de uma extremidade para a outra.

Prenda cuidadosamente a pia isolada com arteríolas parenquimatosas ramificadas da MCA no prato com os pinos e disseque cuidadosamente as arteríolas parenquimatosas. Corte todos os ramos distais restantes e certifique-se de que a arteríola esteja limpa, sem tecido preso. Use esta artéria intacta limpa para digestão enzimática. Alternativamente, corte cada artéria em dois pedaços para digestão enzimática para preparar tubos endoteliais, se desejar.

Para digestão parcial dos segmentos arteriolares, coloque os segmentos arteriolares intactos em 1 mililitro de solução de dissociação em um tubo de vidro de 10 mililitros contendo papaína, ditioeritritol, colagenase e elastase. Incube segmentos arteriolares a 34 graus Celsius por 10 a 12 minutos.

Para isolar o tubo endotelial arteriolar, coloque a pipeta de trituração conectada com o injetor de microsseringa na solução de dissociação na câmara e posicione-a perto de uma extremidade do segmento do vaso digerido. Defina uma taxa dentro da faixa de 1 a 3 nanolitros por segundo no controlador da bomba para uma duração suave do tratamento. Mantendo uma ampliação de 100 a 200 vezes, retire o segmento arterial para dentro da pipeta e, em seguida, injete para dissociar a adventícia e as células musculares lisas. Triturar o segmento do vaso até que todas as células musculares lisas estejam dissociadas e apenas as células endoteliais permaneçam como um tubo intacto.