Diferenciando células-tronco embrionárias de camundongos em uma população de neurônios em rede

Semeie células-tronco embrionárias de camundongos em um prato de baixa fixação contendo meios de diferenciação.

Incubar sob rotação para facilitar a agregação e diferenciação celular em uma linhagem neuronal.

Transfira os agregados para um tubo e deixe-os assentar por gravidade. Descarte a mídia.

Ressuspender e transferir os agregados para a placa de origem que contém meios de diferenciação suplementados com ácido retinóico.

O ácido retinóico induz a expressão gênica neuronal, desencadeando a diferenciação em células progenitoras neurais.

Transfira os agregados para um tubo. Remova a mídia e adicione tripsina para dissociar os agregados.

Adicione um inibidor para neutralizar a tripsina.

Pipetar repetidamente para obter uma suspensão celular homogénea. Filtre a suspensão para remover agregados.

Centrifugue e remova o sobrenadante. Ressuspenda as células na mídia.

Semeie as células em um prato revestido de polímero para facilitar a adesão celular.

Remova a mídia. Adicione novos meios contendo fatores de crescimento para promover a maturação neuronal e formar uma população de neurônios em rede.

A diferenciação de ESCs em neurônios começa durante uma passagem celular de rotina. Dissocie as ESCs como antes, mas inclua uma placa adicional para diferenciação neuronal. Transfira 350 microlitros da suspensão celular para um prato de baixa fixação de 10 centímetros contendo 25 mililitros de meio de diferenciação.

Coloque o prato em um agitador orbital ajustado para 30 a 45 RPM dentro de uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono e incube por 48 horas. Após 48 horas, use uma pipeta de 25 mililitros para transferir os agregados celulares diferenciados para um tubo cônico de 50 mililitros.

Imediatamente depois, adicione 25 mililitros de meio de diferenciação fresco à placa de Petri. Deixe os agregados assentarem por dois a cinco minutos, produzindo um pellet visível com um a dois milímetros de profundidade. Aspire cuidadosamente o meio, ignorando quaisquer células isoladas ou pequenos agregados ainda em suspensão, e use uma pipeta P1000 para transferir o pellet celular de volta para a placa de Petri. Retorne o prato ao agitador rotativo na incubadora. Após mais 48 horas, repita o procedimento de troca de mídia. Desta vez, adicione 30 mililitros de meio de diferenciação suplementado com seis micromolares de ácido trans-retinóico.

A pelota formada agora terá de dois a quatro milímetros de profundidade. Depois de incubar as células como antes, repita o procedimento de troca de meio com suplementação de ácido retinóico pela última vez. O pellet terá de quatro a oito milímetros de profundidade neste ponto.

No dia seguinte, prepare as superfícies de revestimento conforme descrito na parte escrita do protocolo. Na tarde do dia do revestimento, descongele 5 mililitros de meio de tripsinização NPC pré-aliquotado e 0,1% de inibidor de tripsina de soja a 37 graus Celsius. Em seguida, use uma pipeta de 25 mililitros para transferir agregados diferenciadores da placa de cultura para um tubo cônico de 50 mililitros.

Deixe os agregados assentarem por três a cinco minutos e, em seguida, aspire cuidadosamente o meio sem perturbar o pellet. Em seguida, lave o pellet com 5 a 10 mililitros de PBS e, após o assentamento dos agregados, aspire o PBS e repita a lavagem. Após a segunda lavagem do PBS, adicione 5 mililitros de meio de tripsinização NPC ao pellet e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos, sacudindo suavemente o tubo duas a três vezes durante a incubação.

Em seguida, adicione 5 mililitros de inibidor de tripsina de soja a 0,1% às células e misture rapidamente invertendo. Em seguida, triture suavemente as células 10 a 15 vezes com uma pipeta de 10 mililitros até que uma suspensão celular relativamente homogênea seja produzida. Filtre lentamente a suspensão celular através de um filtro de células de 40 ou 70 mícrons colocado em cima de um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, uma vez que toda a suspensão tenha sido filtrada, adicione 1 mililitro de meio N2 ao filtro para lavar as células restantes através do filtro. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 mililitros e centrifugar durante seis minutos a 200 vezes g.

Depois de aspirar o meio, sem perturbar o pellet, triturar em 2 mililitros de meio N2 e, em seguida, adicionar o meio N2 a um volume total de 10 mililitros. Centrifugar durante cinco minutos a 200 vezes g. Aspirar o meio e repetir o processo de lavagem dos pellets, ressuspendendo novamente o pellet em 10 mililitros de meio N2.

Remova uma alíquota das células e conte com um hemocitômetro e repita a centrifugação. Ressuspenda as células em meio N2 até uma concentração final de 1x vezes 10⁷ células por mililitro e coloque em uma densidade de 150.000 a 200.000 células por centímetro quadrado em placas preparadas em DIV menos 1 e coloque na incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius. Mantenha os ESNs de acordo com as instruções do protocolo escrito.