JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 4:43 min • July 8th, 2025
Pegue o giro dentado de um cérebro de camundongo em um tampão de homogeneização a frio.
Dissocia-se mecanicamente para liberar neurônios, glia e células-tronco.
O detergente neutro do tampão permeia as células, liberando núcleos e outras organelas.
Filtre o homogeneizado para remover os detritos do tecido. Em seguida, centrifugue, remova as organelas e ressuspenda no tampão de homogeneização para lisar as células intactas.
Centrifugue novamente, remova o sobrenadante contendo organelas liberadas e ressuspenda os núcleos em um tampão de lavagem.
Filtre para remover quaisquer detritos, centrifugue e remova o sobrenadante.
Introduza uma coloração de DNA fluorescente para marcar todos os núcleos e um anticorpo conjugado com fluoróforo que se liga ao antígeno nuclear neuronal, ou NeuN, marcando os núcleos dos neurônios.
Usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência, identifique agregados com maior intensidade de fluorescência de coloração de DNA e maiores propriedades de espalhamento, separando os núcleos individuais.
Analise os núcleos individuais, separando os núcleos neuronais NeuN-positivos e isolando os núcleos NeuN-negativos pertencentes à glia e às células-tronco.
Homogeneizar o tecido com 10 golpes do pilão A solto, seguidos por 15 golpes do pilão B apertado. Transferir o homogeneizado para um tubo pré-arrefecido de 15 mililitros. Enxágue o homogeneizador Dounce com 1 mililitro de HB frio e combine-o com o mesmo tubo.
Adicione 3 mililitros de HB ao tubo de 15 mililitros e incube por 5 minutos no gelo. Misture esta suspensão de núcleos duas vezes invertendo o tubo suavemente. Usando 0,5 mililitros de HB, pré-umedeça a tampa do filtro de 70 micrômetros colocada sobre um tubo de ensaio de 50 mililitros. Em seguida, coe a suspensão dos núcleos antes de lavar o filtro de células com 0,5 mililitros de HB.
Em seguida, remova o filtro da célula e centrifugue o tubo de ensaio em uma centrífuga de balde oscilante a 500 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda suavemente o pellet em 4 mililitros de HB usando uma pipeta P1000.
Após cinco minutos de incubação no gelo, centrifugar a suspensão a 500 g durante 10 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mililitros de meio de lavagem. Use 0.5 mililitros de meio de lavagem para pré-umedecer uma tampa de filtro de 35 micrômetros sobre um tubo de ensaio de 50 mililitros. Em seguida, coe a suspensão dos núcleos pipetando 0,5 mililitros de suspensão de cada vez usando a pipeta P1000.
Depois de lavar a tampa do filtro com 0.5 mililitros de mídia de lavagem, coloque o tubo no gelo. Transferir o filtrado para um novo tubo de 15 mililitros e centrifugá-lo durante 5 minutos e 4 graus Celsius a 500 g. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 3 mililitros de meios de lavagem.
Repita a centrifugação e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de meio de lavagem com o anticorpo conjugado com AlexaFlour488 e 1 micrograma por mililitro DAPI. Incube a reação por 45 minutos no gelo no escuro.
Para Classificação de Núcleos Ativados por Fluorescência ou FANS, transfira a suspensão de núcleos imunomarcados para um tubo de ensaio de 5 mililitros e coloque-o no gelo até o início do procedimento de citometria de fluxo.
Vortex as amostras por três segundos com intensidade suave antes de colocar os tubos no instrumento FACS.
Para adquirir os dados da suspensão dos núcleos de coloração, defina as portas na altura DAPI e na área DAPI para excluir os detritos celulares e os núcleos agregados. Em seguida, defina as portas na área de dispersão lateral logarítmica ou SSC e na área de dispersão direta logarítmica ou FSC para separar os núcleos individuais dos agregados ou detritos celulares restantes corados com DAPI.
Em seguida, isole a população negativa para NeuNAF488 definindo os portões para a área anti-NeuNAF488 e FSC.
Após a análise, classifique a população negativa para anti-NeuNAF488 em um tubo de coleta de 1,5 mililitro cheio de 50 microlitros de mídia de lavagem usando a estratégia de gating.