Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:59 min. • July 8th, 2025
Tome bactérias geneticamente modificadas em um meio de crescimento de nematóides.
A bactéria carrega um plasmídeo com um gene do fator regulador da cromatina do nematóide.
O meio contém um indutor que desencadeia a expressão de uma RNA polimerase transgênica do genoma bacteriano que transcreve o gene do fator regulador da cromatina em um dsRNA.
Adicione larvas de nematóides transgênicos carregando um gene do fator de transcrição indutor de destino do neurônio sob um promotor de choque térmico.
Após o consumo bacteriano, o dsRNA ingerido gera siRNA que regula negativamente a expressão do fator regulador da cromatina, facilitando a reprogramação do destino celular.
Através das células germinativas dos pais, o siRNA é passado para a progênie.
A regulação negativa da expressão do fator regulador da cromatina nas células germinativas da progênie, indicada por um fenótipo vulvar saliente, permite sua reprogramação.
Aplique choque térmico à progênie, ativando o promotor de choque térmico e expressando o fator de transcrição indutor do destino do neurônio que desencadeia a diferenciação neuronal, transformando células germinativas em neurônios.
Os neurônios expressam uma proteína repórter fluorescente transgênica, facilitando a visualização microscópica.
Transfira manualmente 50 vermes L4 por repetição para uma placa de RNAi NGM. Use um fio de platina. Os vermes L4 podem ser reconhecidos por uma mancha branca aproximadamente na metade de seus lados ventrais. Agora, incube os vermes a 15 graus Celsius no escuro por cerca de sete dias. O IPTG é sensível à luz.
Quando a progênie F1 atingir os estágios L3 e L4, separe-os dos animais parentais maiores e mais grossos. Neste ponto, rastreie o F1 para o fenótipo da vulva saliente, o que indica que o RNAi contra lin-53 foi bem-sucedido. A atividade do RNAi também pode resultar em letalidade, que aumenta acima de 15 graus Celsius. Para ativar G1 e induzir a conversão de células germinativas em neurônios na progênie F1, aplique choque térmico nos vermes por 30 minutos a 37 graus Celsius no escuro. Use uma incubadora ventilada, pois permite um choque térmico mais eficiente.
Após o choque térmico, incube as placas a 25 graus Celsius durante a noite no escuro. É importante evitar a sobreexpressão de Q1 por choque térmico antes de os animais atingirem a fase intermediária de L3. Isso pode levar à expressão da proteína Q1 em tecidos não direcionados. No dia seguinte, configure uma fonte de luz de fluorescência e um filtro GFP para examinar os animais quanto à fluorescência derivada de transgenes na área do meio do corpo.