Isolando células imunes de plexos coróides de camundongos

Posicione o cérebro de um camundongo com o lado dorsal para cima.

Sob um microscópio, separe os hemisférios cerebrais. Afaste o córtex e depois o hipocampo para expor os ventrículos laterais e o terceiro ventrículo.

Colete dois plexos coróides laterais. Estas são estruturas cerebrais ricas em células imunológicas que revestem os ventrículos laterais como um longo véu.

Colete o plexo coróide do terceiro ventrículo, que é uma estrutura curta com uma superfície granular.

Desconecte o cerebelo para expor o quarto ventrículo.

Colete o plexo coróide do quarto ventrículo, que é uma longa estrutura globular com uma superfície granular.

Coloque todos os plexos coróides em um tubo com solução salina tamponada para manter a integridade do tecido.

Adicione uma solução de enzimas digestivas e incube com agitação.

A enzima quebra a matriz extracelular e solta as células.

Adicione um tampão adequado para inativar a enzima.

Centrifugue para assentar as células. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num novo tampão para análise posterior.

Para começar, posicione o cérebro dissecado de um C57 preto 6 com o lado dorsal do camundongo para cima em uma placa de Petri e coloque a placa abaixo das objetivas das lupas binoculares. Enquanto mantém o cérebro no lugar usando uma pinça, insira as duas extremidades de outro par de pinças na linha média entre os hemisférios.

Usando a pinça, puxe o córtex com o caloso e o hipocampo para longe do septo, expondo o ventrículo lateral e uma parte do terceiro ventrículo. Identifique o plexo coróide lateral como um longo véu que reveste o ventrículo lateral e alargamento em ambas as extremidades. Em seguida, usando duas extremidades de uma pinça fina, colete o plexo coróide lateral. Tenha o cuidado de coletar a parte posterior triangular escondida pela dobra posterior do hipocampo.

Em seguida, puxe o córtex com o corpo caloso e o hipocampo do hemisfério contralateral, para longe do septo para expor todo o terceiro ventrículo e o ventrículo lateral oposto. Usando uma pinça fina, colete o terceiro plexo coróide identificado como uma estrutura curta com aspecto de superfície granular. Em seguida, colete o outro plexo coróide lateral.

Em seguida, insira as duas extremidades da pinça entre o cerebelo e o mesencéfalo e separe o cerebelo da ponte e da medula para expor o quarto ventrículo. Em seguida, identifique o quarto plexo coróide como uma estrutura globular longa com um aspecto de superfície granular que reveste o quarto ventrículo da extremidade lateral direita para a extremidade esquerda entre o cerebelo e a medula. Usando uma pinça fina, colete o quarto plexo coróide.

Depois de incubar todos os plexos coróides coletados com colagenase IV, pipete suavemente para cima e para baixo cerca de 10 vezes para finalizar a dissociação. Em seguida, encha o tubo até 1,5 mililitros com tampão MACS para interromper a atividade da colagenase IV. Em seguida, centrifugue as células e descarte o sobrenadante antes de lavá-las com 1,5 mililitros de tampão MACS. Depois de adicionar os grânulos de compensação apropriados e as soluções de anticorpos, incubar as amostras no gelo por 30 a 45 minutos, protegendo-as da exposição à luz. Em seguida, encha os tubos com 1,5 mililitros de tampão MACS.